SVEUČILIŠTE U ZAGREBU MEDICINSKI FAKULTET. Robert Kolundžić

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU MEDICINSKI FAKULTET Robert Kolundžić Utjecaj polimorfizama u genima za interleukin 6 (IL - 6), tumor nekrotizirajući čimbenik alfa 1 (TNF-α1) i transformirajući čimbenik rasta beta 1 (TGF-β1) na stabilnost endoproteza zgloba kuka DISERTACIJA Zagreb, 2006.

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU MEDICINSKI FAKULTET Robert Kolundžić Utjecaj polimorfizama u genima za interleukin 6 (IL-6), tumor nekrotizirajući čimbenik alfa 1 (TNF-α1) i transformirajući čimbenik rasta beta 1 (TGF-β1) na stabilnost endoproteza zgloba kuka DISERTACIJA Zagreb, 2006.

Rad je izrađen u Klinici za ortopediju Klinički bolnički centar Zagreb i Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu te u Laboratoriju za molekularnu patologiju Zavoda za molekularnu medicinu, Institut Ruđer Bošković, Zagreb. Voditelj rada: prof.dr.sc. Dubravko Orlić ZAHVALA Po završetku rada želim najiskrenije zahvaliti svom mentoru, prof. dr. sc. Dubravku Orliću, koji mi je svojim savjetima i potporom pomogao u izradi ovog rada i uz kojeg stalno produbljujem znanja iz endoprotetike zgloba kuka. Osobito sam zahvalan prof dr. sc. Krešimiru Paveliću na prepoznavanju ideje i pružanju mogućnosti izvođenja većeg dijela ovog istraživanja u Laboratoriju za molekularnu patologiju Zavoda za molekularnu medicinu, Institut Ruđer Bošković, Zagreb. Dr. sc. Koraljki Gall Trošelj dugujem osobitu zahvalnost na velikoj pomoći, razradi ideje, edukaciji, pružanju korisnih savjeta i, nadasve, na velikom strpljenju tijekom cijelog istraživačkog rada. Posebnu zahvalnost izražavam doc. dr. sc. Vladimiru Trkulji za pomoć pri statističkoj obradi podataka i drugim prijateljskim savjetima. Srdačno zahvaljujem laborantskoj tehničarki Ivi Karlović na pomoći tijekom provođenja rada u laboratoriju, kao i ostalom osoblju Laboratorija za molekularnu patologiju Zavoda za molekularnu medicinu, Institut Ruđer Bošković, Zagreb. Srdačno zahvaljujem stručnom kolegiju, kao i brojnom osoblju Klinike za ortopediju Kliničkog bolničkog centra Zagreb na razumijevanju i suradnji tijekom izrade ovog istraživanja. Na kraju, najtoplije zahvaljujem svojoj obitelji, koja je uvijek, pa i tijekom pisanja ovog rada koji je od mene iziskivao potpunu predanost, bila uz mene. Zagreb, 2006. Robert Kolundžić

SADRŽAJ: 1. POPIS OZNAKA I KRATICA 2. UVOD 3. ENDOPROTEZA ZGLOBA KUKA 3.1. Povijesni pregled 3.2. Vrste endoproteza zgloba kuka 3.3. Materijali za izradu endoproteze 3.4. Indikacije za ugradnju endoproteze zgloba kuka 3.5. Komplikacije 3.5.1. Aseptička nestabilnost endoproteze zgloba kuka 3.5.1.1. Demografski čimbenici 3.5.1.2. Biomehanički čimbenici 3.5.1.3. Ostali čimbenici 4. BOLEST SITNIH STRANIH ČESTICA 4.1. Koštano remodeliranje 4.2. Upalna reakcija na strane čestice - Bolest sitnih čestica Particle disease 5. MOLEKULARNA MEDICINA 5.1. Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP) 5.1.1. Određivanje prisutva polimorfizama 5.1.1.1. Lančana reakcija polimeraze (PCR) 5.1.1.2. Metoda cijepanje umnoženih odsječaka DNA određenim restrikcijskim endonukleazama 5.2. Važnost polimorfizma pojedinačnih nukleotida u molekularnoj ortopediji 5.3. Interleukin 6 (IL - 6) 5.4. Tumor nekrotizirajući čimbenik - alfa (TNF-α1) 5.5. Transformirajući čimbenik rasta beta (TGF-β1) 5.6. Važnost polimorfizma gena IL 6, TGF-β1 i TNF-α u kliničkoj praksi transplantacija i ugradbeni materijali 1 2 5 5 10 12 14 15 17 20 22 23 24 24 29 34 35 35 36 38 38 39 40 41 42

6. HIPOTEZA 7. SVRHA I CILJ ISTRAŽIVANJA 8. ISPITANICI, MATERIJALI I METODE 8.1. Oblikovanje istraživanja 8.2. Mjesto istraživanja 8.3. Etički aspekt istraživanja 8.4. Ispitanici 8.5. Operacijska tehnika i radiološka evaluacija 8.6. Definicija ishoda mjerenih u istraživanju 8.7. Analiza polimorfizama u genomskoj DNA 8.7.1. Korištene kemikalije, puferi, enzimi i gelovi za analizu polimorfizama gena 8.7.2 Postupci u analizi polimorfizama u genomskoj DNA 8.7.2.1. Izdvajanje DNA iz stanica pune krvi 8.7.2.2. Lančana reakcija polimerazom 8.7.2.3. Provjera uspješnosti umnažanja lančanom reakcijom polimeraze 8.7.2.4. Analiza polimorfizama u genima IL -6 i TNFα1 metodom RFLP 8.7.2.5 Analiza polimorfizma u genu TGF-β1 metodom PCR 9. STATISTIČKA ANALIZA 10. REZULTATI 10.1. Preživljenje totalnih endoproteza kuka do pojave aseptičke nestabilnosti i polimorfizmi analiziranih gena: TGF-β1 položaj 29, TNF-α1 položaj -308 te IL-6 na položajima -597 i -572 10.1.1. Opća svojstva ispitanika i analiziranih endoproteza kuka 45 47 48 48 48 48 49 50 53 54 55 59 59 60 61 62 64 66 73 73 73

10.1.2. Preživljenje endoproteza zgloba kuka i genotipovi na analiziranim lokusima opisni podaci 10.1.3. Procjena združenosti «preživljenja» endoproteze zgloba kuka i genotipova na analiziranim lokusima 10.2. Razvojni poremećaj zgloba kuka i polimorfizmi analiziranih gena: TGF-β1 položaj 29, TNF-α1 položaj - 308 te IL-6 na položajima -597 i -572 11. RASPRAVA 11.1. Povezanost polimorfizma istraživanih gena i nastanka aseptičke nestabilnosti endoproteze zgloba kuka 11.1.1. Svojstva provedenog istraživanja koja osiguravaju internu validnost 11.1.2. Nedostaci provedenog istraživanja 11.1.3. Glavni rezultati i njihov značaj 11.2. Povezanost polimorfizma istraživanih gena i nastanka razvojnog poremećaja zgloba kuka 11.2.1. Svojstva provedenog istraživanja i glavni razultati 12. ZAKLJUČAK 13. SAŽETAK 14. SUMMARY 15. LITERATURA 16. ŽIVOTOPIS 75 80 100 110 110 112 113 114 118 119 122 124 126 128 151

1. POPIS OZNAKA I KRATICA EP endoproteza zgloba kuka IL-6 interleukin 6 TNF-α1 TGF-β1 PCR tumor-nekrotizirajući čimbenik α1 transformirajući čimbenik poticanja rasta β1 lančana reakcija sinteze DNA korištenjem DNA polimeraze (lančana reakcija polimeraze) RFLP metoda cijepanje umnoženih odsječaka DNA određenim restrikcijskim endonukleazama 1

2. UVOD Razvoj tehnika ugradnji totalnih endoproteza početkom 70-tih godina 20. stoljeća revolucionarizirao je liječenje degenerativnih promjena zgloba kuka te omogućio uklanjanje boli kao i poboljšanje funkcije zgloba s posljedičnim poboljšanjem kvalitete života oboljelih (1). Primjena umjetnih zglobova doživjela je golem napredak, pa smo svjedoci nezadrživa razvoja endoprotetske kirurgije gotovo svih zglobova ili većih dijelova koštanoga sustava. Ugradnja raznih endoproteza danas je gotovo rutinski ortopedski operacijski zahvat koji se provodi diljem svijeta. Uz mnogobrojne, nesumnjivo pozitivne rezultate, jedan dio endoproteza može završiti s određenim komplikacijama. Najvažnija kasna specifična komplikacija ovog zahvata jest nastanak nestabilne endoproteze, a najčešći oblik je tzv. aseptička nestabilnost. Njezino najvažnije obolježje je aseptička upalna reakcija u okolici ugrađenih komponenti te postepena blaga demineralizacija kosti koja dovodi do nestabilnosti endoproteze (2-5). Uporabom biokemijskih i imunohistokemijskih metoda dokazan je velik broj posrednika u ovom procesu: staničnih (makrofazi, mononuklearni histiociti, fibroblasti) i humoralnih. Među potonje, se ubrajaju, na primjer, razni kemokini, interleukini (interleukin 1α (IL-1α), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6), interleukin 8 (IL-8), interferoni, tumor-nekrotizirajući čimbenik α (TNF-α1, od engl. tumor necrosis factor alpha), prostanglandin E2 (PGE2), zatim čimbenici rasta u koje ubrajamo: inzulinu sličan čimbenik rasta tipa 1 (IGF-1, od engl. insulin like growth factor) i transformirajući čimbenik poticanja rasta β (TGF-β, od engl. transforming growth factor beta) te čimbenik poticanja rasta kolonija monocita (M-CSF, od engl. macrofage colony 2

stimulating factor) i, nadalje, receptorski aktivator jezgrenog čimbenika kapa-b (RANKL, od engl. receptor activator of NF kappa B ligand ), osteoprotegerin, koštane morfogenetske proteine (BMP, od engl. bone morphogenic protein) i enzime poput laktat-dehidrogenaze, kolagenaze, gelatinaze i metaloproteinaze (6-11). Točna uloga i funkcionalno značenje ovih molekula u nastanku nestabilnosti endoproteza nisu još u potpunosti poznati, no jasno je da se radi o složenoj interakciji staničnih i humoralnih čimbenika koji podržavaju upalu te, izravno ili neizravno, dovode do resorpcije kosti (12). Općeprihvaćeno je stajalište, kako je razvoj aseptičke nestabilnosti postupan proces koji započinje oslobađanjem djelića protetskog materijala uslijed trenja dva dijela endoproteze, ili dijelova endoproteze i kosti. Makrofazi fagocitiraju ove čestice, ali ih ne mogu resorbirati. Stoga dolazi do nespecifične upalne reakcije na strano tijelo. U nekih su bolesnika u proces uključeni i specifični imunološki mehanizmi poput T-limfocitima posredovane preosjetljivosti tipa IV (12). Uzaludno nastojanje makrofaga da svladaju fagocitirane čestice vremenom postaje štetno, zato što izlučuju medijatore upale koji pokreću daljnju reakciju koja, u konačnici, rezultira neravnotežom osteoblastičke i osteoklastičke aktivnosti, odnosno osteolizom kosti. Zahvaljujući ključnoj ulozi čestica endoprotetskog materijala u poticanju procesa aseptičke upale te združenosti količine oslobođenog materijala i intenziteta procesa, ova se bolest naziva i bolest sitnih čestica (12). Uznapredovalost osteolize ili količina oslobođenih čestica dvije su osobitosti, pri čijem je tumačenju potreban oprez (12,13). Osteoliza, nerijetko i opsežna, kao i količina oslobođenih čestica, vidljiva je i kod klinički stabilnih endoproteza. Stoga se nameće pitanje koji čimbenici određuju poticanje upalnog procesa, neovisno o količini oslobođenih čestica. 3

U tom su smislu, počevši od sredine 70-tih godina prošlog stoljeća, ispitivani razni čimbenici, a posebnu su pozornost privukli endoprotetski materijali i tipovi endoproteza. Već je dugo vremena poznato da je polietilen nepodesan materijal za izradu implantata, zato što oslobađa velik broj čestica. Stoga se danas koriste različiti materijali te velik broj modela endoproteza, za koje često nema dovoljno podataka koji bi eventualno ukazivali na razlike u učestalosti nastanka aseptičke nestabilnosti (14). Danas se, ipak, zna da je rizik pojave aseptičke nestabilnosti u svih oblika bescementnih endoproteza obloženih hidroksiapatitom manji u odnosu na cementne endoproteza (bilo femoralnih, bilo acetabularnih dijelova), a najviši je rizik u hidroksiapatitom neobloženih bescementnih endoproteza (15). Unatoč razlikama u učestalosti, aseptička nestabilnost javlja se uz svaki tip materijala ili endoproteze, pri čemu posreduju isti mehanizmi/medijatori (3). Općeprihvaćen je stav, kako individualna sklonost bolesnika, neovisna o spomenutim čimbenicima, značajno doprinosi (ne)nastanku spomenute komplikacije. Analogno drugim multifaktorijalnim bolestima/poremećajima, individualna sklonost oboljevanju povezuje se s genetskim ustrojem jedinke. Za razliku od mnogih drugih bolesti i stanja, istraživanja genetske varijabilnosti kao uzrok nastanka aseptičke nestabilnosti endoproteze kuka u samom su začetku. Nedvojbeno, postoji čitav niz gena kandidata koje bi u tom smislu valjalo istražiti npr., gene koji kodiraju medijatore za koje se zna ili pretpostavlja da sudjeluju u razvoju ovog stanja, gene za njihove receptore, gene koji kodiraju proteine uključene u metabolizam kosti, a nisu izravno uključeni u nastanak ovog stanja i mnoga druga. 4

3. ENDOPROTEZA ZGLOBA KUKA 3.1. Povijesni pregled Nastojanja uspostavljanja gibljivosti zgloba kirurškim putem potječu još iz 19. stoljeća. Već su Barton (1826.) i Rodgers (1830.) pokušali intertrohanternom osteotomijom ostvariti pseudartrozu i određenu pokretljivost kod ankiloze kuka, ali s prolaznim rezultatom (1). Metode kirurškog preoblikovanja osteotomijom ili resekcijom kosti sa stvaranjem pseudartroze i novog zgloba dugo su bile jedine i nepovoljne metode kirurškog uspostavljanja funkcije zgloba. Početkom 20. stoljeća, češće su se počeli koristiti interpozitumi (fascija, mast, mišić, koža) kako bi se spriječilo zarašćivanje reseciranog ili rekonstruiranog dijela zgloba (1). Prvu opću interpozicijsku artroplastiku vjerojatno izvršio Rehn u Freiburgu, Njemačka, početkom 30-tih godina prošloga stoljeća (16). Niti ova metoda se nije pokazala uspješnom, osobito kada je bila primjenjena na velike zglobove noge. Kasnije su se počeli primjenjivati interpozitumi s različitim anorganskim tvarima (srebro, zlato, gutaperka, celuloid, najlon i dr.), takoder s lošim ishodom. Tek je Smith-Petersen (godine 1933.), primjenom svoje cup-plastike kao oblikovanog interpozituma metala, između čašice i glave bedrene kosti, postigao bolje i trajnije rezultate (1). Prvu totalnu artroplastiku kuka izvršio je Wiles u Londonu godine 1938. Implantat se sastojao od dvije čelične komponente (17). Prije nego što se spoznalo da samo totalna endoproteza kuka, koja se satoji i od acetabularnog i od bedrenog dijela, može osigurati dugotrajan uspjeh u liječenju osteoartroze kuka, čitavo desetljeće i pol provodila se je ranije gotovo isključivo hemiartroplastika. Sve su endoproteze u tim postupcima implantirane bez cementa. 5

Imale su na truplu udubljenja i/ili otvore koji su pojačavali fiksaciju urastanjem kosti u endoprotezu (18,19,20). McKee, te McKee i Watson-Farrar pokušali su razviti totalnu endoprotezu kuka koja se sastojala od dva metalna dijela. Prvi model izrađen je 1940. godine, ali nikada nije upotrebljen u kliničkoj praksi. Drugi model, iz 1951. godine, sastojao se od metalne acetabularne komponente učvršćene u zdjelici i metalne glave pričvršćene zavrtanjem u vrat bedrene kosti. McKee-jev treći model sastojao se od metalne čašice, također pričvršćene u zdjelicu, ali je glava bedrene kosti zamijenjena Thompsonovom endoprotezom, učvršćenom u medularni kanal. Rezultati tih postupaka bili su slabiji od očekivanih sve dok početkom 60-tih Charnley nije uveo koštani cement u ortopedsku kirurgiju (21). McKee je 70-tih napisao: 1960. godine metilmetakrilat se počeo upotrebljavati kao koštani cement i odmah je poboljšao postotak uspjeha, koji je sada veći od 90%. Uspjeh se pripisuje činjenici da se kod koštanog cementa povećava površina opterećenja, a kod uporabe navoja ona se koncentrira u jednoj točki. McKee je vjerojatno želio istaknuti ključ problema endoprotetičke fiksacije: to je jednakomjerna raspodjela sila između kontaktnih površina endoproteze i kosti. Ranih 60-tih, Sivash iz SSSR-a je razvio posebne bescementne endoproteze, često primjenjivane u istočnoeuropskim državama, no većina ih je kasnije zamijenjena zbog velikog broja nestabilnosti i drugih neuspjeha (22). Ring je, 1964. godine, uveo totalnu bescementnu endoprotezu kuka koristeći metal-metal endoproteze s acetabularnom fiksacijom, tj. zavrtanjem dugog nastavka u kost. Nakon 1979. godine, više je upotrebljavao i proučavao bescementnu metal-polietilen endoprotezu (23). Sir John Charnley prvi je u endoprotetiku zgloba kuka uključiti obnavljanje površine glave i acetabuluma s teflonskim pokrovom. Zamisao je propala na samom početku zbog 6

razvoja aseptičke nestabilnosti bedrenog dijela i reakcije na strano tijelo pri primjeni teflonskog materijala kao u acetabularnoj komponenti (24). Smanjenjem veličine glave endoproteze i uvođenjem acetabularne komponente od polietilena velike gustoće, 1962. godine, nastao je implantat koji je stvorio temelje kasnijih modernih dizajna endoproteza. Godine 1967. Müller je razvio zakrivljeni bedreni dio endoproteze koja je mogla biti implantirana korištenjem modifikacije Watson-Jonesova anterolateralnog pristupa. Charnleyev bedreni nastavak bio je ravan u svoje distalne dvije trećine. Promjer glave bedrenog dijela Müllerove endoproteze bio je 32 mm, a glava Charnleyeve endoproteze u promjeru je iznosila 22 mm (24). Prvi pokušaji zamjene kuka, izvođeni između 1965. i 1975. godine, imali su kratkotrajne dobre rezultate. Ipak, nisu u potpunosti prihvaćeni, jer je u tom desetogodišnjem razdoblju bilo i 10-30% neuspjelih zahvata. Međutim, u drugome razdoblju - od kasnih 70-tih i 80-tih - rezultati su bili puno bolji, ponajviše zbog boljeg endoprotetičkog dizajna, tehnike cementiranja i same kirurške tehnike (25,26). Usporedno s rješavanjem problema oblikovanja i materijala endoproteza te njihove primjene, liječnici su sve više počeli proučavati veliki problem koji se odnosi na aseptički gubitak kosti nakon ugradnje endoproteze. Periprostetsku osteolizu nastalu oko loše cementiranog bedrenog dijela prvi je 1975. godine opisao Charnley. Povezao je cistične erozije kosti s reakcijom makrofaga oko bedrenog dijela endoproteze. Harris je, 1976. godine, (27) izvijestio o četiri opsežne resorpcije bedrene kosti, nakon ugradnje endoproteze. Zamijetio je kako opseg resorpcije upućuje na prisutnost infekcije ili tumora. Godine 1977., Willert i Semlitsch (28) izvjestili su da metalnim djelićima različitih neuspjelih kobalt-kromij zglobnih 7

endoproteza primarno pohranjenih unutar makrofaga u zglobnoj kapsuli, što je povezano i s povećanom fibrozacijom tkiva. Ta su istraživanja postavila hipotezu o određenoj ravnotežnoj situaciji. Naime, ravnoteža postoji kada se mali komadići debrisa metala, nastali zbog trenja dijelova endoproteza, transpotiraju putem limfatičkog sustava ili se pohranjuju u intracelularnu kapsulu makrofaga. U slučaju opsežnog trošenja endoproteze i prekomjernog oslobađanja čestica, ravnoteža se poremeti što rezultira lokalnim zadržavanjem tih stranih čestica i stvaranju granuloma oko endoproteze (29,30). Goldring i suradnici su, 1983. godine (31,32), opisali sinovijsko membranozno okruženje oko olabavljene cementiranog bedrenog dijela totalne endoproteze. Postojanje ove membrane pokazalo je da postoji mogućnost oslobađanja medijatora koji djeluju na resorpciju kosti, i smatra se da ima ključnu ulogu u nastanku žarišne osteolize. Kasniji izvještaji o osteolizi, povezanoj sa stabilno cementiranim bedrenim nastavkom, ukazali su na činjenicu da samo olabavljenje nije nužno za razvoj osteolize. Jasty i ostali (33) opisali su četiri slučaja osteolize u kojima je bila dokazana povezanost sa stabilnim cementiranim bedrenim dijelovima. U osteolitičkom tkivu su se nalazile nakupine makrofaga i divovskih stanica koje su erodirali femoralni korteks. Ostaci debrisa polimetilmetakrilata (PMMA) bili su prisutni, ali polietilenski debris nije pronađen. Maloney i suradnici (34) su analizirali 25 bolesnika s uznapredovalom osteolizom kostiju. Histološka je analiza pokazala nakupine makrofaga i divovskim stanica, koje su sličile stanicama koje su postojale kada je postajala nestabilnost cementiranih bedrenih dijelova. Uporabom posebne tehnike mikroskopiranja serijskih rezova i biomehaničkim ispitivanjem na preparatima dobivenim post-mortum, autori su potvrdili prisutnost lokalne frakture cementa koja je bila povezana s žarišnom osteolitičkom lezijom, 8

pronađenom u stabilnih implantanata (35). Ovi su nalazi ukazali na ulogu loma ili defekta u cementnom sloju u patogenezi lokalnih osteoliza. Koncept tzv. cementne bolesti potaknut je, zapravo, otkrićem djelića PMMA u uzorcima kosti zahvaćenih osteolitičkim procesom, oko stabilne i labave endoproteze te u područjima resorpcije (36). Neuspjesi prvih pres feet endoproteza, kao i endoproteza korištenih bez koštanog cementa rijetko su bili povezani s nastankom osteolize. Histološki nalaz, uz pres feet bedreni nastavak nije pokazivao PMMA djeliće, što upućuje na hipocelularnu, a ne na upalnu pseudmembranu. Na prijelazu između kosti i vezivnog tkiva pokazana je organizacija kolagena i osifikacija vezivnog tkiva. S druge strane, tkivo u kojem se dašavala aktivna resorpcija kosti, koje je sadržavalo strane čestice - PMMA, imalo je i histiocite okružene divovskim stanicama. Mallony i ostali (37) pratili su 16 pacijenata s žarišnim endoostealnom osteolitičkom destrukcijom kosti tijekom tri i više godina nakon ugradnje bescementnih totalnih endoproteza. U 14 su bolesnika postignuti izvrsni klinički rezultati, bez dokaza o labavljenju. Njihova je studija dokazala da strane čestice PMMA, UHMWPE (ultrahigh-molecular-weight polyethylene) i metala mogu potaknuti progresivnu resorpciju kosti s posljedičnim labavljenjem. Stoga je prvotni naziv cementna bolest zamijenjen mnogo preciznijim nazivom bolest čestica ili particular disease. Iako je većina radova o osteolizi bila skoncentrirana na bedreni dio endoproteze, osteoliza se pojavljuje i oko acetabularnog dijela endoproteze, što je povezano s loše cementiranom acetabularnom dijelom. Lezije se mogu prikazati na zglobnom rubu acetabularnog dijela endoproteze ili centralno. Prevalencija osteoliza povezanih s bescementnim acetabularnim dijelom endoproteza različita je i ovisi o tipu ugrađenih komponenti i vremenu proeklom od 9

ugradnje. Xenos i suradnici (38) su, prateći stotinu bescementnih PCA komponenti tijekom najmanje sedam godina (7-9 godina) opisali 12% incidenciju osteolize i 4% incidencu osteolize acetabularnog dijela endoproteze. Endoproteze su bile napravljene od kobalta i kroma. Beauchensne i suradnici (39) pratili su anatomsku medularnu ukotvljenu AML endoprotezu tijekom šest ili više godina (u prosjeku 7 i pol godina) i otkrili osteolizu bedrene kosti u 23% pacijenata i osteolizu acetabularnog dijela endoproteze u 15% pacijenata. Zanimanje znanstvenika za problematiku aseptičke nestabilnosti endoproteza, odnosno za bolest sitnih čestica, vrlo je velika. 2.2. Vrste endoproteza zgloba kuka Endoproteze zgloba kuka razvrstane su prema različitim kriterijima (40). 3.2.1 S obzirom na broj dijelova endoproteze Endoproteze zgloba kuka mogu biti: Djelomične ili parcijalne endoproteze kuka Potpune ili totalne endoproteze kuka Djelomična endoproteza kuka, kao što sam naziv govori, nadomješta samo jedan konveksni dio zgloba kuka. U povijesti se djelomična endoproteza kuka upotrebljavala kao cup-plastica koja je prekrivala glavu bedrene kosti, odnosno zamjenjivala zglobnu površinu glave bedrene kosti. S vremenom, su se razvili noviji modeli. Poboljšanje je, u tehničkom smislu, postignuto uvođenjem parcijalne bedrene endoproteze s bedrenim nastavkom koji proksimalno simulira vrat i glavu bedrene kosti. Glave endoproteze mogu se mijenjati s obzirom na razne promjere acetabuluma. 10

Totalna endoproteza kuka jest endoproteza koja zamjenjuje oba zglobna tijela kuka: bedreni i acetabularni dio. 3.2.2. Prema načinu fiksacije Endoproteze zgloba kuka mogu biti: a) Bescementne endoproteze b) Cementne endoproteze c) Hibridne endoproteze. Važna razlika između cementnih i bescementnih endoproteza jest u njihovim površinama i u njihovu obliku. Cementne endoproteze imaju potpuno glatke plohe, dok bescementne moraju biti hrapave, s mikro i makro porama na površini u koje kasnije urasta kost. Kod cementnih se endoproteza upotrebljava koštani cement (metilmetakrilat) čija je primarna zadaća povećanje dodirne površine između endoproteze i ležišta u kosti za približno 200 puta. Na ovaj se način smanjuje opterećenje po jedinici dodirne površine. Kod bescementnih je endoproteza vrlo je važna dobra primarna fiksacija endoproteze u ležištu kosti, nakon čega vremenom slijedi urastanje kosti u mikro i makro pore, što se naziva sekundarna fiksacija endoproteze. Težnja je izvršiti cijeli zahvat fiksacije uz što manji proces oštečenja okolnog tkiva, što se postiže boljim oblikovanjem i poboljšanjem mehaničkih osobina endoproteze (41). Hibridne su endoproteze kombinacija prethodne dvije: dio endoproteze je bez cementa (najčešće acetabularni dio), dok se za drugi dio koristi koštani cement (češće bedreni dio) (42). 3.2.3. Prema indikacijama za ugradnju 1. Totalne endoproteze možemo podijeliti na: 2. Standardne ili primarne endoproteze 11

3. Revizione ili sekundarne endoproteze 4. Specijalne endoproteze - tumorske Standardne endoproteze su cementne i bescementne endoproteze, koje se upotrebljavaju u liječenju primarnih i sekundarnih degenerativnih promjena zgloba kuka, zatim u liječenju tumora u gornjem okrajku bedrene kosti i kod zbrinjavanja prijeloma u području glave bedrene kosti. Standardne endoproteze su danas modularne, tj. može se najveći broj bolesnika uspiješno rješiti s kombinacijom raznih veličina. Revizione endoproteze se najčešće upotrebljavju u rješavanja kasnih komplikacija, npr. nestabilnih standarnih endoproteza, a češće je danas riječ o bedrenim dijelovima endoproteze. Specijalne endoproteze posebno su oblikovane, vrlo duge, modularne endoproteze koje se koriste u rekonstruktivnoj kirurgiji kod liječenja tumora kosti odnosno u rješavanju opsežnih oštećenja gornjeg okrajka bedrene kosti, a mogu biti i rastuće endoproteze koje prate rast djece. 3.3. Materijali za izradu endoproteze Nastojanja ortopeda, imunologa, inženjera, tehničara i mnogih drugih u teorijskim i eksperimentalnim istraživanjima, dovela su do nastanka kvalitetnih endoproteza, načinjenih od dobrih materijala. Materijali za izradu endoproteza moraju posjedovati određenu čvrstoću (lom, zamor materijala itd.), postojanost na oštećenja (trošenje zglobnih površina i koroziju), dobru biološku podnošljivost (reakcija na strano tijelo toksičnost te kemijske, kancerogene i imunološke reakcije). Također je važna reakcija na sterilizaciju prilikom koje ne smiju biti narušene osobine endoproteze. I na kraju, one moraju biti dostupne i povoljne po cijeni. 12

Reakcija organizma na implantat vrlo je složena. Ovisi o veličini i obliku implantata, njegovoj stabilnosti, eventualnoj razgradnji. U fiziološkim se uvjetima uvijek stvara tanak sloj vezivnoga tkiva, između implantata i kosti. Niti jedna vrsta aloplastičnog materijala nije idealan. U posljednje se vrijeme upotrebljavaju različiti materijali, metali i slitine koje organizam dobro podnosi. To su kemijski otporni nehrđajući čelik, titan-krom, kobalt, molibden, nikal i drugi. Prve totalne endoproteze kuka bile su izrađene samo od metala (McKee, Ring, Sivaš i dr.) ili su se kombinirale s plastičnim masama (Charnley, Müller-Charnley, Bucholz, Weber i dr.). Potpuno metalne endoproteze malo se troše, ali imaju veći postotak olabavljenja. Endoproteze izrađene od kombinacije metala i plastike se, s druge strane, više troše. Plastične mase, kao biostabilni materijali, imaju posebno mjesto u izradi dijelova endoproteze zglobova. Uveo ih je Charnley, na načelu svoje tzv. low friction endoproteze (43). Pojedine njihove kvalitete, u pogledu modula elastičnosti, plastičnosti i loma, a s tim u vezi i apsorpcije energije i prijeloma zbog zamora te dezintegracije u upotrebi, vrlo su pogodne za primjenu u organizmu. Vrlo dobro odgovaraju i na intermitentno opterećenje i trenje uz razmjerno malo trošenje. Posebno su pogodne za obradu pa su se zbog svojih mehaničkih i bioloških reakcija danas afirmirali kao rješenje acetabularnog dijela endoproteze, naravno uz primjenu koštanog cementa. Uz dobru podnošljivosti, plastične su mase pokazale dobru elastičnost u odnosu na koštano tkivo. Posebno mjesto u izradi acetabularnog dijela endoproteze zglobova imali su biostabilni polimeri (Endlerov acetabularni dio) (44). Neko su se vrijeme, za izradu dijelova endoproteza, upotrebljavali keramika i aluminij. Povoljne značajke keramike su vrlo dobra podnošljivost od strane organizma i 13

mali koeficijent trenja. Međutim, ipak je prečvrsta i češće podložna pucanju (lomovima). 3.4. Indikacije za ugradnju endoproteze zgloba kuka Najvažnije indikacije za potpunu zamjenu zgloba prikazane su u tablici 1. Tablica 1. Indikacije za ugradnju endoproteze kuka. primarne koksartroze idiopatske reumatoidno upalni procesi avaskularna nekroza razvojni poremećaji kuka sekundarne koksartroze poslijedica prijeloma metabolički poremećaji neuropatski poremećaji endokrini poremećaji hemofilija prijelomi i posljedica loše liječenih prijeloma posljedica neprikladno obavljenih operativnih zahvata neoplastični procesi Najvažnija indikacija za potpunu zamjenu zgloba kuka je degenerativno oštećen zglob i to idiopatske etiologije. Nadalje, potpuna zamjena zgloba s endoprotezom u 14

suvremenoj ortopediji sve se češće primjenjuje kod prijeloma, posljedica prijeloma kuka i posljedica neuspijelog liječenja prijeloma. Tu spadaju: svi prijelomi u području glave i vrata bedrene kosti, gdje djeluju nepovoljni biomehanički uvjeti, tj. smične sile koje neizbježno dovode do neuspjeha osteosinteze, prijelomi glave bedrene kosti te prijelomi u području acetabuluma. S endoprotezom zgloba kuka danas se uspiješno liječe sve sekundarne degenerativne promjene zgloba kuka, kao što je kod razvojnih anomalija zgloba kuka (displazija acetabuluma, subluksacija ili luksacija kuka), avaskuarnih nekroza glave bedrene kosti, reumatskih upala s ograničenom gibljivošću zgloba, određenih smetnji rasta, te sistemskih bolesti. Zatim se upotrebljava endoproteza za rekonstrukciju gornjeg okrajka bedrene kosti nakon resekcije tumora u bloku. Također se primjenjuje endoproteze kod izraženog ili prijetećeg patološkog prijeloma gornjeg okrajka bedrene kosti (45). Indikacije za primjenu endoproteza ovise o mnoštvu čimbenika, kao npr. o patološkim promjenama u zglobu, odnosu morfoloških promjena i funkcionalnih tegoba te o funkcionalnom stanju ostalih zglobova. Posebno su važne bolesnikove subjektivne tegobe i njegova dob. 3.5. Komplikacije Ugradnja totalnih endoproteza zgloba kuka rutinski je zahvat, a broj bolesnika kojima je ugrađena endoproteza zgloba kuka neprekidno raste. Implantacija endoproteza zgloba kuka postalo je zahvat koji primjenjuju mnogi ortopedi. Na ovaj operativni zahvat, kao i svaki drugi, nosi određene rizike i komplikacije koje prema lokalizaciji možemo podijeliti - na sistemske i lokalne, a prema vremenskom pojavljivanju - na intraoperacijske (tablica 2) i postoperacijske (46). 15

Tablica 2. Najčešće komplikacije tijekom artroplastike zgloba kuka. anesteziološke i metaboličke neurovaskularne prijelom bedrene kosti prijelom zdjelice štetno djelovanje koštanog cementa na krvni tlak prekomjerno krvarenje tijekom zahvata Nakon što se endoproteza zgloba kuka ugradi i neposredno postoperativno razdoblje prođe bez komplikacija, a bolesnik se počinje služiti ugrađenom endoprotezom. No, niti tada ne prestaju opasnosti od komplikacija, a najčešće su koje su posljedica više elemenata: 1. komplikacije koje nastaju uslijed tehnički ne idealnih odnosa endoproteze; 2. komplikacije koje nastaju kao poradi istrošenosti dijela kosti ili endoproteze te time uvjetovanih bioloških promjena uslijed reakcije organizma na strane sitne čestice; 3. komplikacije kao posljedice povrede, a u vezi s istrošenošću ili slabljenjem pojedinih dijelova endoproteze ili kosti, a u vezi s endoprotezom. U odnosu na vrijeme pojavljivanja, postoperacijske komplikacije možemo podijeliti u rane i kasne. U rane ubrajamo one koje nastaju unutar 3 mjeseca od operativnog zahvata, i najčešće su: tromboza, alergične reakcije, hematom, površinksa infekcija, luksacija endoproteze, komplikacije osteotomije veliko trohantera i periartikularne kalcifikacije. Kasne komplikacije nastaju nakon više od 3 mjeseca od 16

operativnog zahvata. U kasne infekcije spadaju: duboka infekcija, prijelom bedrene kosti s ugrađenom endoprotezom zgloba kuka, prijelom endoproteze, aseptička nestabilnost endoproteze zgloba kuka - Bolest sitnih čestica ili Particle disease te sistemske i različite dugotrajne komplikacije. 3.5.1. Aseptička nestabilnost endoproteze zgloba kuka Mnoge legure, plastični materijali, a u posljednje vrijeme i keramika koja se primjenjuju u konstrukciji endoproteza kuka, danas, ali teorijski jamče gotovo neograničenu trajnost endoproteze, odnosno njezin minimalni koeficijent trošenja. Medutim, činjenica je kako u kliničkoj praksi trajnost ugrađene endoproteze dobiva posve drugačiju dimenziju. Rasklimavanje, olabavljenje i pomak endoproteze u kasnijem su postoperativnom razdoblju upravo onaj problem koji je potencijalno uvijek prisutan i koji, bez obzira na prisustvo ili odsustvo infekcije, ugrožava njezinu stabilnost, a time i osnovnu svrhu njezine ugradnje, a to je uspostavljanje pokretljivosti i otklanjanja boli (47). Pomak endoproteze kuka ima posebne značajke s obzirom na zakone biomehanike, morfološke osobine endoproteze i zgloba te prijenos sila opterećenja preko ugrađene endoproteze na ležište u kosti. U dijagnostici olabavljenja i pomaka endoproteze važno je obratiti pozornost na bolesnikovo subjektivno stanje bol u preponi, otežan hod, bol u natkoljenici, te osjećaj nesigurnosti prilikom opterećenja. Važan klinički nalaz koji ukazuje na smanjenu pokretljivost zgloba su: atrofija muskulature i otežan hod. Dodatne dijagnostiki postupci uključuju standardnu radiološku dijagnostiku i scintigrafiju. Radiološki nalazi pokazuju da kod bedrenog dijela endoproteze, čije je olabavljenja ipak učestalije od acetabularnog, primarno dolazi do resorpcije kosti, s posljedičnim popuštanjem uporišta 17

endoproteze, upravo na medijalnom dijelu reseciranog vrata bedrene kosti. Radiološki se analizira posebno bedreni dio endoproteze, a posebno acetabularni dio. Na bedrenom se dijelu endoproteze pozornost treba obratiti na promjene u području bedrenog kalkara, položaj trupa endoproteze u kanalu (pomak distalnog dijela), promjene spužvastog dijela bedrene kosti, promjene na cementu i odnos implantat - cement - kost (radiolucentna zona). Pri analizi acetabularnog dijela endoproteze, prati se promjena položaja čašice - kut nagiba, promjene na koštanom dijelu (atrofija - sklerozacija), promjene na čašici (trošenje - lomovi) i odnos - cement - kost (radiolucentna zona). Najvažniji element koji upućuje na olabavljenje endoproteze jest povećanje širine radiolucentne linije te njezino proširenje uz bedreni ili acetabularni dio endoproteze. S obzirom na rezultate ili pretraga radiološki napravljene su klasifikacije koje imaju veliku ulogu u otkrivanju nestabilnosti endoproteze (Kruglugerova klasifikacija) (48) te u odabiru načina operativnog liječenja, odnosno rekonstruktivnih zahvata. Dok, dvije najčešće korištene klasifikacije koštanih defekta su: klasifikacija Američke akademije ortopeda i Paproskyjeva klasifikacija (49,50). Inače, aseptički gubitak kosti dugotrajna je komplikacija nakon ugradnje endoproteze, i pojavljuje se u prisutnosti sitnih čestica svih materijala i endoprotetskih sistema koji su ikada primjenjivani (51-54). Gubitak kosti nakon ugradnje endoproteze može biti ozbiljan problem u revizijskoj operaciji te može ograničiti opseg rekonstruktivnog zahvata. Gubitak kosti otežava značajno reoperaciju i može zahtijevati autologni ili homologni koštani presadak. Postoje tri čimbenika koji negativno utječu na održavanje koštane mase nakon ugradnje endoproteze: 1. sekundarni gubitak kosti zbog debrisa stranih čestica; 18

2. adaptivno koštano remodeliranje i sekundarni stres shelding zbog osobina materijala i površinskih svojstava endoproteza; 3. gubitak kosti kao posljedica prirodnog starenja. Sekundarni gubitak kosti zbog debrisa sitnih čestica nastaje zbog prisustva sitnih čestica koje se oslobađaju trošenjem, korozijom te oslobadanjem s površine materijala. Štetni učinci djelića materijala mogu biti različiti. Danas su poznati metabolički, bakteriološki, imunološki i karcinogeni učinci o kojima, za sada, znamo relativno malo. Jedan od uzroka nastanka ovih komplikacija je materijal koji se koristi za izgradnju dijelova endoproteze. Svakako je potrebno istaknuti visokomolekularni polietilen, koji služi za izradu cijelog acetabularnog dijela cementnih endoproteza, ili umetka kod bescementnih acetabularnih dijelova. Dugo je postojala dvojba može li se pojava agresivne osteolize oko dijelova endoproteze objasniti djelovanjem metala, koštanog cementa metilmetakrilat, odnosno visokomolekularnog polietilena, ili je svaki od tih sastojaka pojedinačno odgovoran za nastanak komplikacije. Trenjem metalne glave endoproteze i polietilenskog acetabuluma oslobađaju se velike količine stranih čestica, što pospješuje razvoj bolesti stranih čestica ili, ako se oslobađa samo polietilenska čestica, polietilenske bolesti (55,56). Bolest stranih čestica nastaje zbog upale, kao odgovora organizma na strane čestice (metal, koštani cement, polietilen) koje nastaju abrazijom ili trenjem dva dijela endoproteze. Strane čestice moraju biti izrazito male (do 10µm) kako bi ih mononuklearni histiociti, multinuklearne gigantske stanice mogle fagocitirati. Tijekom upalne reakcije strane čestice stimuliraju stvaranje medijatora koštane resorpcije (IL - 1, IL - 6, IL 8, TGF-β, TNF-α, PGE2), što za posljedicu ima aseptičku nestabilnost endoproteze. 19

Međutim, aseptička nestabilnost javlja se uz svaki tip materijala ili endoproteze, a u tome posreduju isti mehanizmi/medijatori (3). Velik broj endoproteza napravljenih od različitih materijala i različitih konstrukcija, za koje često nema dovoljno sigurnih relevantnih podataka za pouzdanu procjenu eventualne razlike u učestalosti, razvijaju aseptičku nestabilnost (14). Jasno je da je rizik pojave aseptičke nestabilnosti kod svih oblika bescementnih endoproteza obloženih s hidroksiapatitom manji nego kod cementnih endoproteza (bilo femoralnih, bilo acetabularnih dijelova). Rizik za nastanak kod hidroksiapatitom neobloženih bescementnih endoproteza (15). Nadalje, čimbenici s mogućim utjecajem na nastanak aseptičke nestabilnosti mogu se podijeliti na demografske, biomehaničke i ostali. 3.5.1.1. Demografski čimbenici Dob. Analize velikih serija (poput onih temeljenih na norveškom ili švedskom registru), endoproteza kuka, s više tisuća ili više desetina tisuća endoproteza (45, 57,58) ukazuju da je rizik nastanka aseptičke nestabilnosti veći, odnosno da je vrijeme preživljenja endoproteze (aseptička nestabilnost kao ishod) kraće, u ljudi kojima se endoproteza ugrađuje u mlađoj životnoj dobi. Pritom rezultat ne ovisi o bolesti koja je uzrokovala potrebu za ugradnjom endoproteze, o vrsti endoproteze i materijala, spolu i drugim čimbenicima. Ishod je lošiji za bolesnike koji su u vrijeme ugradnje endoproteze mlađi od 55 godina, u odnosu na one u dobi višoj od 55 godina (57, 58). Također, je lošiji za osobe mlađe od 46 godina u odnosu na bolesnike u dobi 46-55 godina (57,58). Lošiji ishodi u mlađih bolesnika mogli bi biti posljedica veće fizičke aktivnosti, i posljedično, većeg opterećenja endoproteze u mlađoj životnoj dobi (15). Spol. U presječnoj studiji, Wilkinson i suradnici (57) su analizirali 217 bolesnika u kojih je nastala aseptička nestabilnost endoproteze i 267 bolesnika sa stabilnim 20

endoprotezama. U studiji nije analizirano vrijeme preživljenja endoproteze: od ugradnje do pojave aseptičke nestabilnosti, već združenost pojave aseptičke nestabilnosti s pojedinim čimbenicima. U logističkoj binarnoj regresijskoj analizi (aseptička nestabilnost da/ne), uz korekciju za utjecaj dobi, endoproteze, vremena proteklog od ugradnje endoproteze i razloga za ugradnju endoproteze, mogućnost nastanka aseptičke nestabilnosti bila je nešto veća, iako ne statistički značajno, u muškaraca (omjer mogućnosti 1,4; 95% granice pouzdanosti 1,0 do 2,0; p=0,09). S druge strane, ciljano istraživanje preživljenja endoproteze (do pojave aseptičke nestabilnosti) na 4600 endoproteza u bolesnika kod kojih su endoproteze ugrađene zbog primarne osteoartroze i u dobi mlađoj od 55 godina, a koje je temeljeno na podacima iz finskog registra (15), pokazalo je da je rizik pojave aseptičke nestabilnosti veći uz graničnu značajnost (relativni rizik 1,2; 95% granice pouzdanosti 1,0-1,4; p=0,05), odnosno preživljenje endoproteze kraće je kod žena, neovisno o tipu endoproteze ili drugim čimbenicima. Shodno tome, zasad nema jednoznačnih podataka o spolu kao predviđajučem čimbeniku za nastanak aseptičke nestabilnosti endoproteze kuka. Nastaje i u muškaraca i u žena pa razlike u odnosu na spol, ako i postoje, nisu posebno izražene. Indeks tjelesne mase. Pretjerena tjelesna masa (indeks tjelesne mase >25, a posebno >30) jest klasičan čimbenik koji doprinosi (pre)opeterećenju koštano-mišićnog sustava pa tako i endoproteze kuka. Međutim, istraživanje utjecaja visokog indeksa tjelesne mase na pojavu aseptičke nestabilnosti združeno je s određenim problemima. Naime, s obzirom na to da se radi o istraživanjima vremena proteklog do događaja, u kojim se bolesnici prate tijekom duljeg vremenskog razdoblja (npr. 10-tak i više godina), utjecaj pojedinih potencijalnih čimbenika na preživljavanje endoproteze analizira se uz pretpostavku stalnog rizika ( constant hazard assumption ). Pretpostavka je da je rizik 21

stalan tijekom vremena (npr., dob u vrijeme operacije, vrsta endoproteze, spol, bolest koja je dovela do potrebe za endoprotezom itd.). Indeks tjelesne mase može se tijekom vremena znatno mijenjati. Među literaturnim podacima nema praktično niti jedne studije u kojoj je indeks tjelesne mase uključen u analizu pojavnosti aseptičke nestabilnosti kao varijabla ovisna o vremenu. Stoga je teško realno procijeniti utjecaj ovog čimbenika na pojavu aseptičke nestabilnosti. U jednoj studiji kraćeg trajanja, indeks tjelesne mase >30 vrijeme ugradnje endoproteze, identificiran je kao negativan čimbenik za preživljenje endoproteze (59). Svakako treba naglasiti da se aseptička nestabilnost javlja i u bolesnika s trajno fiziološkim indeksom tjelesne mase. 3.5.1.2. Biomehanički čimbenici Stupanj fizičke aktivnosti i indeks tjelesne mase utječu na sile koje djeluju na endoprotezu, pa se također smatraju i biomehaničkim čimbenicima. Daljni potencijalno važan čimbenik bile bi konstrukcijske, odnosno biomehaničke osobine endoproteze (60). Postoji velik broj modela endoproteza koje se neznatno razlikuju s obzirom na detalj konstrukcije. Nema podataka na temelju kojih bi se došlo do zaključaka o razlikama u pojavnosti aseptičke nestabilnosti. koja bi se mogla pripisati konstrukcijskim svojstvima endoproteze. Također, nema podataka koji bi ukazali da su operativni zahvati, koje je katkad potrebno izvesti uz ugradnju endoproteze (acetabuloplastika ili pak osteotomija trohantera), a koji mijenjaju biomehaničku situaciju u zglobu kuka, važni za pojavnost aseptičke nestabilnosti endoproteze. S druge strane, inklinacijski kut acetabuluma postignut prilikom ugradnje endoproteze, značajno utječe na pojavu aseptičke nestabilnosti. Naime, cilj je ostvariti kut od 45 stupnjeva, pri čemu se toleriraju odstupanja od +/- 5 stupnjeva. Nepovoljan inklinacijski kut acetabuluma povećava rizik od nastanka aseptičke nestabilnosti 22

endproteze (61,62,63). Pokazalo se, međutim, da do aseptičke nestabilnosti endoproteze dolazi i kod zadovoljavajućeg inklinacijskog kuta (40 50 stupnjeva). 3.5.1.3. Ostali čimbenici Bolest zbog koje je ugrađena endoproteza. Na temelju analize oko 54000 endoproteza iz norveškog registra endoproteza kuka (45), zaključeno je da je rizik nastanka aseptičke nestabilnosti veći u bolesnika s razvojnim anomalijama kuka, u odnosu na one kojima je endoproteza ugrađena zbog drugih razloga (npr. primarna osteoartroza, aseptička nekroza glave bedrene kosti, ozljeda itd.). Iskustvo operatera i vrijeme trajanja operacije. Na temelju analize oko 32000 endoproteza (cementne i bescementne endoproteze) iz norveškog registra (62,64) pokazano je kako iskusniji operateri (mjereno brojem godišnjih operacija) prosječno troše manje vremena za ugradnju endoproteze u odnosu na manje iskusne operatere. Neovisno o dobi i spolu bolesnika, tipu endoproteze ili bolesti koja je dovela do potrebe za endoprotezom, rizik nastanka aseptičke nestabilnosti bio je veći kod bolesnika liječenih od strane manje iskusnih. Rizik aseptičke nestabilnosti veći je ako operacije traju dulje od prosječnih 90 minuta. Također, rizik je veći ako operacija traje kraće od 50 minuta. Svi navedeni čimbenici samo manjim dijelom objašnjavaju varijabilnost pojavnosti aseptičke nestabilnosti endoproteze kuka. 23

4. BOLEST SITNIH ČESTICA 4.1. Koštano remodeliranje Kost nije inertna. Njezina pregradnja zbiva se različitim intenzitetom tijekom cijelog života jedinke, u okviru održavanja homeostaze koštanog sustava. Proces razgradnje i stvaranja kosti u uzajamnoj su interakciji i u homeostazi. Pregradnja se odvija u jedinicama koštane pregradnje, koje se sastoje od koštanih stanica, osteoblasta i osteoklasta te njihovih progenitora (65-67). Regulacija pregradnje, odnosno metabolizma kosti uključuje složen sustav citokina, čimbenika rasta i hormona koji utječu na aktivaciju osteoblasta, stvaranje i funkciju osteoklasta, te na međuodnos tih stanica (68,69). Aktivacija takve jedinice počinje osteoklastičnom resorpcijom, a nastalu prazninu oblika stošca popunjavaju osteoblasti novostvorenom kosti. Brzina pregradnje, kao i količina resorbirane i novostvorene kosti, ovisi o broju aktiviranih jedinica pregradnje te o broju i stanica unutar nje (70,71). Funkcija osteoblasta i osteoklasta usko je povezana. Stanice osteoblastične loze sintetiziraju molekule koje započinju i kontroliraju diferencijaciju osteoklasta s jedne strane, dok s druge strane sintetiziraju molekule koštanih morfogenetskih bjelančevina (BMP, od engl. bone morphogenetic proteins). Ove su bjelančevine pripadnici u nadobitelj transformirajućeg čimbenika rasta tipa beta. Potiču osteoblastogenezu, odnosno diferencijaciju progenitorskih stanica u osteogenom smjeru, što se klinički manifestira stvaranjem kosti i lokalnim povećanjem koštane mase (72-75). 4.1.1. Osteoklastogeneza Aktivacija osteoklastičnog procesa započinje sazrijevanjem osteoklasta iz stanica preteča, što zahtijeva prisustvo stromalnih stanica koštane srži. Osteoblasti proizvode 24

različite molekule nužne za osteoklastogenezu, od kojih je važno spomenuti čimbenik poticanja rasta kolonija monocita (M-CSF, od engl. macrofage colony stimulating factor) i receptorski aktivator jezgrinog čimbenika Kapa-B (RANKL, od engl. receptor activator of NF kappa B ligand) (76-80) (slika 1). Slika 1. Genetička kontrola diferencijacije osteoklasta (Slika korištena iz rada Troen i sur. (80)). RANKL je bjelančevina koju proizvode osteoblasti nakon vezanja s receptorskim aktivatorom jezgrinog čimbenika Kapa-B (RANK), transmembranskim proteinom na preosteoklastu, koji potiče njegovu diferencijaciju u osteoklast. Najveća količina glasničke RNA (mrna) za RANKL protein dokazana je u trabekulama kosti i koštanoj srži te limfatičnom tkivu koje aktivno sudjeluje u imunološkom odgovoru. RANKL se, osim na membrani osteoblasta, može dokazati i u slobodnom obliku. Vezan na 25

membrani osteoblasta, RANKL omogućuje sazrijevanje osteoklasta dok njegov slobodan oblik inhibira vezanja preosteoklasta i osteoblasta, što za posljedicu ima smanjeno sazrijevanje osteoklasta. U diferencijaciji progenitora osteoklasta sudjeluju, osim proteina RANKL-RANK, još i IL-1, IL-6, IL-8, TNF-alfa, TGF-beta i M-CSF (81,82). Molekula M-CSF vežu se na receptore preosteoklasta i aktiviraju signal za proliferaciju osteoklasta. Nakon aktivacije M-CSF-om i vezanja RANKL-RANK dolazi do promjene oblika receptora RANK. Svojim oblikom postiže formu na koju se mogu vezivati TRAF (TNF udruženi receptorski čimbenici). Aktivirani TRAF uzrokuje aktivaciju NF-kapaB transkripcijskog čimbenika. On se aktivira i ulazi u jezgru, veže se na promotore gena odgovornih za proliferaciju osteoklasta. U mnogim radovima dokazane su promjene količine M-CSF i RANKL u uvjetima in vitro te njihov učinak na diferencijaciju i sazrijevanje osteoklasta (67,79-83). Neposredno nakon osteoklastičnog slijedi osteoblastični diferencijacijski proces. 4.1.2. Osteoblastogeneza Osteoblastični proces uključuje regrutiranje i diferencijaciju osteoblastičnih stanica s usporednim kaskadnim aktivacijama različitih molekula tijekom faze intenzivne proliferacije i sazrijevanja osteoblastične diferencijacije te sinteze različitih molekula (69) (slika 2). U regulaciju osteoblastičnog procesa uključen je cijeli niz sustavnih i lokalno proizvedenih čimbenika (83). 26

Slika 2. Stanice koje nastaju iz diferencijacije matične stanice. Za osteoblastični proces odgovorne su stanice osteoblastične linije te visoka aktivnost enzima alkalne fosfataze te vezanje paratireoidnog hormona i čimbenika rasta, inzulinu slični čimbenici rasta tipa I i II (IGF-I, IGF-II), epidermalni čimbenik rasta (EGF), čimbenik rasta porijeklom iz fibroblasta (FGF), čimbenik rasta porijeklom iz trombocita (PDGF), transformirajuči čimbenik rasta beta 1 (TGF-β1) te razni citokini, na primjer interleukin 1 i interleukin 6 (84-87). Nova kost nastaje uz prisustvo kolagena tipa I i velikog broja nekolagenih proteina koštanog matriksa, kao što su osteokalcin, osteonektin, osteopontin i neki drugi. Ovi proteini sudjeluju u stvaranju koštanog matriksa i utječu na sposobnost mineralizacije (88). Osteoblastične stanice mogu sintetizirati koštane morfogenetske proteine, odgovorne za stvaranje kosti (89). Ovi proteini imaju nezaobilaznu regulacijsku ulogu u procesima morfogeneze i popravka kosti, kao i u fazi održavanja fiziološke homeostaze. Mehanizam djelovanja sastoji se u aktivaciji molekule iz prekusorskih kompleksa, te njihovim međusobnim djelovanjem s drugim specifičnim veznim proteinima i receptorima stanične površine (90). Intracelularni aktivirani 27

kompleks drugih glasnika prenosi signale u jezgru preko kompleksa SMAD koji, uz cijeli niz koaktivatora i korepresora, stvaraju preduvjet za aktivaciju ciljnih gena (primjerice, gena BMP-2 i BMP-4) (91). Kontrola prijenosa signala molekulama SMAD odvija se na vrlo složenim razinama, a uključuje posebne transportne molekule (SARA protein) te različite mehanizme povratne sprege (92) (slika 3). Aktivacijom gena za koštane morfogenetske proteine nastaje ključni preduvjet za složeni proces diferencijacije osteoblastičnih stanica, kako za inicijaciju, tako i za održavanje zrelog osteoblastičnog fenotipa (17). Slika 3. Shematski prikaz BMP receptora I i II te SMAD i SARA proteina koji sudjeluju u prijenosu signala od stanične površine do jezgre. Inače, složeni homeostatski mehanizam stvaranja i resorpcije kosti, koji je u fiziološkim uvjetima i pod utjecajem hormona, npr. estrogena, dodatno se komplicira 28

stanjima upale, prijeloma, menopauze, promijenjenih mehaničkih sila ili bolesti koje karakterizira promijenjena gustoća kosti (80). 4.2. Upalna reakcija na strane čestice - Bolest sitnih čestica ( Particle disease ) Ako sve prije navedene činjenice koristimo u analizi aseptičke nestabilnosti endoproteza zgloba kuka, možemo reći da postoji upalna reakcija, kao odgovor organizma na strano tijelo. Produkti upalne reakcije negativno utječu na homeostazu neophodnu za pravilno koštano remodeliranje. Za razvijanje upalne reakcije nije važno koja je čestica u pitanju. Značaj ima njezina veličina i koncentracija. Upalnu rekaciju nastalu zbog prisustva stranih čestica nazivamo bolešću sitnih čestica ili particle disease. U bolesnika s bolešću sitnih čestica dolazi do upalne reakcije, što rezultira poremećenom homeostazom osteoblasta i osteoklasta, zbog čega nema kvalitetnog koštanog remodiliranja, što se klinički očituje kao nestabilna endoproteza zgloba kuka. U literaturi spomenuti pojmovi, kao što je osteoliza i/ili aseptičko olabavljenje endoproteze, predstavljaju jednaki patološki proces s jednakim bazičnim mehanizmima. Odgovor tkiva ovisi o nekoliko čimbenika: o stupnju olabavljenja endoproteze, o vrsti endoprotetskog materijala, o vremenu trajanju implantata te o količini i veličini stranih čestica (debrisa). Strane čestice najčešće su metal, koštani cement i polietilen. Nalazimo ih unutar zglobne tekućine i/ili u periartikularnom tkivu. Mehanizam stvaranja metalnih djelića je mehanički; nastaju najčešće abrazijom i/ili trenjem dijelova endoproteze (glave i vrata, glave i acetabuluma) (slika 4). 29

Slika 4. Mjesta na kojima se oslobađaju sitne čestice uslijed abrazije i trenja kod cementnih i bescementnih endoproteza zgloba kuka. (Slika kopirana iz rada Wilert i suradnici (5)). Djelići polietilena oslobađaju se pri trenju metalne glave o polietilenski acetabulum (označeno na slici A kao Ia), pri trenju metalne glave o metalni vrat bedrenog dijela endoproteze (označeno na slici A kao III) i/ili abrazijom polietilenskog dijela ili metalnog dijela o kost (označeno u slici A kao II b), a djelići koštanog cementa nastaju isključivo abrazijom o kost (označeno u slici A kao II a). Postoje tri mehanizma širenja stranih čestica: 1. preko perivaskularnih limfnih prostora; 2. regionalno širenje; 3. pasivnom disiminacijom preko otvorenih prostora zgloba. Transport makrofazima u perivaskularnim limfnim prostorima, za posljedicu ima odnošenje stranih čestice daleko 30

od mjesta stvaranja u novoformiranim kapsulama oko zglobova, koštanoj srži i u tkivima, na granici između kosti i implantata. Na taj način debris može biti odnesen centripetalno, područja, u regionalne limfne čvorove. Oko umjetnih zglobova oslobođene će strane čestice, ako su manje od 12 nm, biti fagocitirane u mononuklearnim histiocitima i multinuklearnim gigantskim stanicama i razviti će se reakcija na strano tijelo (Slika 5) (6,7). Slika 5. Prikaz osnovne patogeneze kronične upale na strane čestice. Reakcija tkiva na metalne dijelove endoproteze, kao i reakcije na UHMWPE ili PMMA djeliće, jednake su i ovisi o količini i veličini oslobođenih djelića. Najvažnije stanice u ovom procesu su makrofazi. Kada makrofazi fagocitiraju strane čestice, lizozomski enzimi i superoksid-radikali oslobađaju se intracelularno te djeluju na takav materijal. U odgovoru na strane čestice, ove stanice mogu izlučivati nekoliko medijatora upale, kao što su interleukini (IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8), tumor nekrotizirajuči čimbenik (TNF-α), prostaglandin E2 (PGE2), laktička dehidrogenaza, 31

kolagenaza, želatinaza i metaloprotenaza (4-14, 93). Točna uloga svakog medijatora vjerojatno će se tek otkriti. Strane čestice, ovisno o koncentracije, mogu, uz ostalo, utjecati na izlučivanje staničnih medijatora, što je izravno povezano s pojavom resorpcije kosti. Izgledno je da su u osteolitičkom procesu sitnije čestice izazivaju snažniji odgovor u odnosu na velike (5). Mnogi citokini mogu imati višenamjenske aktivnosti, regulirati jedni druge ili mogu interferirati s ekspresijom receptora pojedinih tvari koje uzrokuju koštane resorpcije, kao što su metaloproteinaza i cikloustanaza. S obzirom na vrstu stranih čestica pri tkivnoj reakciji, oslobađaju se različiti medijatori koštane resorpcije. Kod tkivne reakcije na metal izlučuje se prostaglandin E2, kod tkivne reakcije na polietilen izlučuje se IL-1, TNF-α, a kod tkivne reakcije na koštani cement izlučuje se TNF-α. Histološki, tkivna reakcija sadrži nekrozu udruženu s opsežnom granulomatoznom reakcijom kao neželjenim učinkom kako na kostima, i tako na drugim tkivima koja okružuju umjetni zglob. Nekroza se u pravilu razvija u području velikih granuloma zbog poremećaja opskrbe krvlju. Na mjestima gdje postoji radiolucentna linija koja govori u prilog aseptičkog olabavljanja endoproteze kuka, makroskopski se nailazi na granulacijsku opnu (pseudokapsulu) koja mikroskopski sadržava sve osnovne elemente upalne tkivne reakcije s prisutnim stranim česticama. Prisutna su i polja nekroze (slika 6). 32

Slika 6. Patohistološka slika pseudokapsule koja je nastala između polietilenskog acetabularnog dijela endoproteze i kosti. Vidljiv je veliki broj stranih čestica u izvanstaničnom prostoru. Mehanički čimbenici, procesi starenja i adaptacije koštanog remodeliranja pridonose gubitku kosti nakon ugradnje endoproteze kuka, no ipak se najodgovornijim mehanizmom smatra biološka reakcija organizma na strane čestice. Oslobađanje i širenje stranih čestica, upalna lokalna reakcija i prihvaćanje tih čestica kao stranog tijela, pa čak i razvoj osteolize zbog stvaranja granuloma, nisu specifično vezani za neki posebni materijal. Zaključno, nazivi kao što su metal disease, cement disease ili polietilen disease općenito su neodgovarajući te je, stoga, preporučen naziv - bolest stranih čestica ili particle disease. 33

5. MOLEKULARNA MEDICINA Molekularna medicina je područje medicine unutar kojeg se nastanak bolesti istražuje na molekularnoj razini (94). Razumijevanje nastanka patološkog procesa na razini molekularnih promjena je bazično znanje na kojem bi se trebalo temeljiti sveobuhvatno znanje o nastanku, ali i liječenju određene bolesti, odnosno stanja. Primjena molekularne medicine u ortopediji u samom je začetku, za razliku od nekih drugih područja, kao što je, na primjer, molekularna onkologija. Spoznaje o molekularnim mehanizima nastanka bolesti danas se koriste u dijagnostici različitih vrsta artritisa, nasljednih bolesti lokomotornog sustava, kao što su koštane displazije, ili metaboličkih bolesti, npr. osteoporoze, rahitisa, osteopoikiloze (95) i mnogih drugih. Projektom Genom čovjeka (engl. Human Genome Project), koji se temeljio na sekvencioniranju molekule DNA, pokazano je da u svim genima postoji polimorfizam nukleotida (SNP, od engl. single nucleotide polimorphysm), koji ne moraju nužno dovesti do nastanka polimorfnog proteina ako je polimorfizam u intronu, odnosno zbog degeneriranog koda tripleta nukleotida. S druge strane, zbog prisustva polimorfizma protein može biti promijenjen. Polimorfizam je zamjena nukleotida u molekuli DNA, uobičajena u populaciji, pri čemu se niti jedan alel ne smatra standardnim. Umjesto toga, postoje dvije ili nekoliko podjednako zastupljenih sljedova DNA. Smatra se da granica između polimorfizma i mutacije iznosi 1%. Drugim riječima, da bi se promjena sljeda nazvala polimorfizmom, učestalost u populaciji mora biti od jedan ili više posto (96). Ako je učestalost manja od 1%, tada se promjena u sljedu DNA smatra mutacijom (97). Mutacija je također promjena sljeda nukleotida u molekuli DNA, pri čemu u populaciji postoji prevladavajući tip alela. Za razliku od polimorfizma mutacija dovodi 34

do nastanka sljeda nukleotida koji je vrlo rijedak u populaciji i nerijetko se manifestira bolešću, odnosno, određenim patološkim fenotipom. Polimorfne promjene u molekuli DNA nisu razlogom nastanka bolesti. Najčešće se nalaze u nekodirajućim područjima molekule DNA i njihovo se postojanje, stoga, ne odražava na građu i funkciju proteina. 5.1. Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP) Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP) je naziv za zamjenu jedne baze drugom (npr, A umjesto G). Polimorfizmi se, u prosjeku, pojavljuju jednom na 250 baza, čineći tako više od 3 milijuna varijacija u genomu čovjeka (98). Polimorfizam DNA može biti izazvan različitim mehanizmima, između ostalih - rekombinacijom i greškama nastalim tijekom replikacije molekule DNA (99). Do danas je otkriveno 1,8 milijuna SNP. Ovi podaci su pohranjeni u baze podataka dostupne javnosti (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp; http://www.snp.cshl.org). Najviše pažnje pobuđuju SNP koji utječu na ispoljavanje gena, odnosno mijenjaju građu proteina. Pretpostavlja se da broj takvih SNP u genomu čovjeka između 50 000-250 000 (100-103). Učestalosti SNP na autosomima je veća nego na spolnim kromosomima (103-106). 5.1.1. Određivanje prisutva polimorfizama Polimorfizmi gena mogu se otkriti različitim metodama: a) metoda lančane reakcije polimerazom (PCR, od engl. polymerase chain reaction), korištenjem početnih oligonukleotida koji su na 3 kraju komplementarni određenom polimorfnom nukleotidu; b) cijepanje odsječaka DNA određenim restrikcijskim endonukleazama (određivanje duljine restrikcijskih ulomaka RFLP, od engl. restriction fragment length 35

polymorphism); c) metodom Lightcycler, koja se temelji na lančanoj reakciji polimeraze uz vrlo brze izmjene temperaturnih ciklusa; d) metodom koja se temelji na bioluminiscenciji pirofosfata nastalih u specifičnim proba-produljenim reakcijama (BAMPER, od engl. Bioluminometric Assay Coupled With Modified Probe Extension Reactions); e) bioinformatičkim programima kojima je moguće izračunati mjesto SNP (Immunoblot/Genoblot Scanning System WGSA, od engl. Whole-Genome Shotgun Assembly) (98,107-112). U ovom istraživanju korištene su metoda lančane reakcije polimerazom (PCR) i cijepanje odsječaka DNA restrikcijskim endonukleazama (RFLP). 5.1.1.1. Lančana reakcija polimerazom (PCR) Lančana reakcija sinteze DNA korištenjem DNA polimeraze, PCR, je postupak umnažanja DNA in vitro, u tijeku kojeg se umnažaju (ciljano uvišestručuju) željeni sljedovi gena. Metoda je osjetljivija od bilo koje do danas upotrijebljene i njome se može otkriti, između ostalog, samo jedna ciljna molekula u prisutnosti velikog broja ostalih. Preduvjet za izvođenje reakcije je poznavanje sljeda nukleotida rubnih dijelova odsječka DNA koji se želi umnožiti, na temelju kojeg se konstruiraju početni oligonukleotidi (engl. primer) i postojanje barem jedne početne molekule DNA koja u reakciji ima ulogu kalupa (templata). U reakciji dolazi do prepisivanja obaju lanaca DNA koji se nalaze izmedu 3' rubnih dijelova početnih oligonukleotida, uvijek u smjeru 5' 3'. Nakon vezanja početnog oligonukleotida na DNA (po načelu komplementarnosti), oni se produljuju (prema postojećem kalupu) ugradnjom slobodnih nukleotida DNA-polimerazom. Rezultat prvog kruga je udvostručen broj ciljnih molekula (94,113). 36

Jedan krug umnažanja sastoji se od tri koraka koji se izvode na različitim temperaturama (114). Svaki ciklus započinje razdvajanjem lanaca (denaturacija), nastavlja se sparivanjem početnih oligonukleotida i završava produžavanjem lanca. Optimalan broj ciklusa ovisi o mnogim čimbenicima, najčešće količini i kvaliteti DNA. Prevelikim brojem ciklusa povećava se količina neželjenih produkata reakcije dok premali broj dovodi do stvaranja vrlo malih količina produkata PCR. U optimiziranoj reakciji obično se izvodi 25-40 temperaturnih ciklusa. Umnoženi odsječci detektiraju se, nakon završene elektroforeze, u gelu agaroze ili gelu poliakrilamida. Uspješnost izvođenja reakcije ovisi o pravilnom odabiru uvjeta umnažanja (vrijeme i temperatura), količini početne DNA, kao i ostalih sastojaka reakcijske smjese (115). Količina DNA koja se koristi u reakciji najčešće je 0,5 µg /l00µl. PCR je, najčešće u kombinaciji s nekim drugim metodama, nezamjenjiv u molekularnoj medicini. U dijagnostici je prvi put korišten za prenatalno postavljanje dijagnoze anemije srpastih stanica, genetskog oboljenja uzrokovanog mutacijom gena za β-globin (116). Ova metoda je baza (u kombinacijama s drugim metodama) za otkrivanje mutacija gena odgovornih za nastanak β-talasemije, cistične fibroze, zloćudnih tumora, za otkrivanje bakterija, te DNA i RNA virusa (117-119). Osim za dijagnozu genetskih oboljenja, primjena PCR znatno olakšava analizu određivanja sklonosti pojedinim oboljenjima, npr. dijabetes tipa II i reumatoidni artritis (120). Također, ova metoda koristi i u sudskoj praksi (121). 37

5.1.1.2. Metoda cijepanje umnoženih odsječaka DNA restrikcijskim endonukleazama (RFLP) Metoda cijepanje umnoženih odsječaka DNA određenim restrikcijskim endonukleazama (RFLP) jedna je od metoda kojima se otkriva polimorfizam odsječka molekule DNA. Osnova metode je u slijedećem: postojanje određenog polimorfnog nukleotida u određenom odsječku DNA dovest će do stvaranja novog, odnosno uklanjanja postojećeg restrikcijskog mjesta za određenu restrikcijsku endonukleazu. 5.2. Važnost polimorfizma pojedinačnih nukleotida u molekularnoj ortopediji Polimorfizmi u genima za citokine koji sudjeluju u stvaranju i održavanju koštane mase imaju posebno važno mjesto u molekularnoj ortopediji (122-126). Interleukin 6 (IL-6) i TGF-β1 su dva upalna citokina za koje postoje dokazi za uključenost u nastanak aseptičke nestabilnosti endoproteze zgloba kuka (127). Određeni polimorfizmi u promotorskom području gena IL-6, npr transverzija G C na položaju -572, povezuju se s povećanom transkripcijskom aktivnošću gena IL-6 (128) i posljedično, povećanom gustoćom minerala u kostima žena nakon menopauze (122,129). Polimorfizam u kodirajućem području TGF-β1, na položaju 29 (T C tranzicija), povezuje se sa sniženom transkripcijskom aktivnošću TGF-β1 i smanjenom gustoćom minerala u kostima u žena nakon menopauze (122,130). Do danas je objavljen samo jedan rad u kojem je analiziran polimorfizam gena TNF - α1 u bolesnika s endoprotezom zgloba kuka, te njegov utjecaj na razvijanje nestabilnosti endoproteze (57). SNP TNF-α (-238; G A tranzicija) povezan je s pojavom aseptičke nestabilnosti, nakon potpune artroplastike kuka. Prisutnost nukleotida A na položaju -308 u promotorskom području (G A tranzicija) povezan je s 38

transkripcijom gena TNF-α1, te povećanom sklonošću prema različitim upalnim procesima (131). Također, protein TNF-α1 posreduje i u osteolitičkim procesima. Utjecaj polimorfizama pojedinačnih nukleotida u genima za IL-6, TNF -α1 i TGF-β1, kao čimbenika u ranom odbacivanju endoproteze zgloba kuka nitko nije analizirao. 5.3. Interleukin 6 (IL - 6) Interleukin 6 (IL-6) je multifukcionalan citokin, koji se sintetizira u mnogim stanicama: makrofazima, T-stanicama, fibroblastima i endotelnim stanicama (132-135). Također ga mogu producirati bakterije i virusi. Neki citokini, na primjer interleukin 1 i tumor nekrotizirajući čimbenici mogu potaknuti njegovu sintezu. Gen IL-6 je smješten na kromosomu 7 (7p21) (137), gdje zauzima 1125 pb genomske DNA. Sastoji se od pet eksona i četiri introna. Zreli interleukin 6 je glikoprotein molekulske mase 23 718 Da, a čine ga 212 aminokiseline (136,137). Do danas je poznato 147 polimorfizama u ovom genu (136,138). Unutar eksona su poznata 54 polimorfizama; 12 ispred kodirajućeg područja, 37 u kodirajućem području i 5 iza kodirajućeg područja. U literaturi se spominje pod različitim imenima: interferon beta-2 (IFN-β2), čimbenik diferencijacije B limfocita (engl. B-cell differentiation factor), stimulirajući čimbenik B limfocita (BSF2, od engl. B-cell stimulatory factor 2), stimulirajući čimbenik hepatocita (HSF, od engl. hepatocyte stimulatory factor), čimbenik rasta hibridoma (HGF, od engl. hybridoma growth factor) (137). Osnovna uloga interleukina 6 je: regulacija imunološke reakcije kao pro-upalni i protu-upalni citokin; remodeliranje kosti. Najvažnije djelovanje interleukina 6 zasniva 39

se na završnoj diferencijaciji B-limfocita i poticanju biosinteze sekrektornog tipa imunoglobulina (Ig) na razini mrna (138, 139,140). Također, interleukin 6 potiče sintezu slijedećih proteina: fibrinogen, alfa-1-antikimotripsin, alfa 1 kiseli glikoprotein, serumski amiloid A i C-reaktivni protein (CRP) (141). Interleukin 6 ima proosteoklastično (aktivaciji progenitora osteoklasta nakon čega započinje proces osteoklastogeneze) i proosteoblastično djelovanje (izravna aktivacija osteoblasta) (136,142-146). 5.4. Tumor nekrotizirajući čimbenik alfa1 (TNF-α1) Tumor nekrotizirajući čimbenik - alfa je multifunkcionalan citokin koji posjeduje antitumorsku aktivnost (147). Izlučuju ga makrofagi, monociti, neutrofili, T limfociti, astrociti, glatke mišićne stanice i fibroblasti nakon stimulacije mikroorganizmima ili stranim česticama (148,149). Gen TNF-α1 nalazi se na kromosomu 6 (6p21.3) (150), gdje zauzima 1660 pb genomske DNA. Posjeduje 4 eksona koji kodiraju nastanak proteina molekularne mase 25 644 Da, koji sadrži 233 aminokiseline (150). Do danas je poznato 715 polimorfizama ovog gena (150). Receptori za TNF-α1 nalaze se na gotovo svim stanicama uključujući i eritrocite te stanice sinovijalne tekućine i sinovijalne membrane. Povećana količina topivih receptora dokazana je u oboljelih od reumatoidnog artritisa, sistemskog lupusa eritematozusa, sistemske skleroze i osteoartritisa (151-154). U malim količinama, TNF-α1 djeluje na ciljne stanice parakrinom i autokrinom regulacijom. To znači da potiče ispoljavanje receptora na endotelnim stanicama što omogućuje pojačanu adheziju neutrofila, monocita i limfocita. Ovo je ujedno i najvažniji 40

lokalni učinak TNF-α1. Također, u malim količinama potiče endotelne stanice da luče kemokine, osobito IL-8 (152). U velikim količinama, ako ulazi u krv, djeluje kao endokrini hormon i ponaša se kao endogeni pirogen (149,153). TNF-α1 je važan čimbenik u remodeliranju kosti: aktivira progenitore osteoklasta i započinje proces osteoklastogeneze (154). 5.5. Transformirajući čimbenik rasta beta (TGF-β1) Transformirajući čimbenik rasta beta je multifunkcionalan citokin (155), koji sudjeluje u proliferaciji i diferencijaciji velikog broja stanica, ali također može djelovati i antiproliferativno, ovisno o vrsti stanica (156,157). Potiče sintezu ekstracelularnog matriksa, inhibira njegovu razgradnju, djeluje kao imunosupresor. U glatkim mišićnim stanicama, fibroblastima i hondrocitima potiče bimodalni odgovor, u smislu proliferativnog ponašanja (158-164). Stoga, TGF-β1 u ovim stanicama djeluje kao autokrini čimbenik rasta. Također, TGF-β1 može djelovati kao negativan regulator staničnog ciklus. Gen TGF-β1 je smješten na kromosomu 19 (19q13.1) (155,165), gdje zauzima 2555 pb genomske DNA. Sastoji se od 7 eksona i 6 introna. Glasnička RNA dugačka je 1173 baze; kodira protein molekularne mase 44341 Da, koji sadrži 390 aminokiselina (165, 166). Do danas je poznato 106 polimorfizama u ovom genu (155,167). Gen TGF-β1 aktivan je u gotovo svim stanicama čovjeka. Član je superobitelji TGF-β (TGF-βSF, od engl. transforming growth factor beta superfamily), u kojoj se nalazi veliki broj polipeptida (npr. koštani morfogenetski proteini, BMPs, od engl. bone morphogenetic proteins; GDFs, od engl. growth differentiation factors; GDNFs od engl. glial derived neurotrophic factors; MIS, od engl. mullerian inhibiting substance) (159). 41

Oni se razlikuju se po veličini molekule (npr. molekularnoj masi TGF-ß je 25000 Pa, a TGF- α 5600 Pa) i naravno, u funkciji. TGF-β1 inhibira proliferaciju T- i B- limfocita, timocita, makrofaga, NK- i LAK stanica (168). Ovaj citokin ima značajan utjecaj na remodeliranje kosti. Djeluje kao RANKL inhibitor, što se očituje inhibiranjem osteoklastogeneze. Poznato je da aktivacija osteoklastičnog procesa započinje sazrijevanjem osteoklasta iz stanica preteča, što zahtijeva prisustvo stromalnih stanica koštane srži. Osteoblasti sintetiziraju različite molekule nužne za osteoklastogenezu, od kojih je važno spomenuti čimbenik poticanja rasta kolonija monocita (M-CSF) i receptorski aktivator jezgrinog čimbenika Kapa-B (RANKL) (77,78). TGF-β, također, djeluje kemotaksično na osteoblaste i na deferencijaciju osteoblasta iz matičnih stanica (169,170). 5.6. Važnost polimorfizma gena IL 6, TGF-β1 i TNF-α u kliničkoj praksi transplantacija i ugradbeni materijali Do danas je objavljeno oko 1250 radova koji opisuju povezanost polimorfizama u genima IL-6, TGF-β1 i TNF-α s određenim bolestima. Mali broj radova opisuje povezanost polimorfizma u ovim genima s ranim odbacivanjem transplantiranog organa, naročito bubrega i srca, odnosno - implantata nakon kardioloških ili stomatoloških zahvata. Poli i sur. (2002) (171) su iznjeli da polimorfizam gena ima utjecaj na djelovanje imunosupresivne terapije te na taj način utječe na odbacivanje transplantiranog organa. Pogotovo takvo djelovanje imaju polimorfizmi na genima TNF-α, IL-6 i TGF-β1 (172). 42

Müller-Steinhardt i sur. (173), su nedavno objavili rad u kojem su pokazali povezanost polimorfizama u genu IL-6 s preživljenjem bubrežnog transplanta. Dokazali su da kombinacija genotipova na pozicijama -597, -572 i -174 u promotorskom području gena IL-6 imaju veči utjecaj na preživljenje bubrežnog transplantata. Alakulppi i sur. (174) su analizirali polimorfizam u genu TNF-α i pokazali su da bolesnici s genotipom AA na -308 TNF-α imaju veliki rizik od akutnog odbacivanja transplantata bubrega. Postoji nekoliko radova koji povezuju preživljenje kardioloških transplantata i određenih genotipa. Awad i sur. (175) su pokazali da postoji povezanost između genetskog polimorfizma koji posjeduje alel A u genu TGF-β1 na položajima -800 i -509 u promotroskom području te na kodon položajima 869 i 915 sa stvaranjem fibroze pluća nakon transplantacije pluća. Aziz i sur. (176) su, promatrali povezanost polimorfizma u genu TGF-β1 sa stvaranjem koronalne vaskulopatije nakon urađene transplantacije srca i povišenim koncentracijama TGF-β1 u krvi nakon zahvata. Došli su do zaključka da polimorfizam u genu TGF-β1 ima utjecaj na povišene vrijednosti TGF-β1 i na stvaranje koronalne vaskulopatije. S druge strane, slična su istraživanja radili Gourley i suradnici (177), pri čemu su promatrali povezanost polimorfizama u genima TGF-β1, IL-10, IL-6 i INF- γ i odbacivanje srca te nisu našli povezanost. Densem i sur. (178) su pokušali povezati genotip donora i peživljenje srca, odnosno razvoju koronarne vaskulopatije. Analizirali su polimorfizme kodona 915 i 869 u genu TGF-β1 i zaključili su da nema združenosti. Brazilska grupa stomatologa (179,180,181) analizirala je povezanost polimorfizama gena, i to: položaj -509 (C T) i -800 (C A) u genu TGF- β1, položaj - 308 (G A) u genu TNF-α te položaj 330 (T G) u genu IL-2 i položaj -174 (G C) u 43

genu IL-6 s preživljenjem implantata u čeljusti. Nisu našli statistički značajno povečan rizik olabavljenja implantata u analiziranoj populaciji. Analogno ovim radovima, koji govore o povezanosti polimorfizama gena IL-6, TGF-β1 i TNF-α s odbacivanjem transplanta ili implantata, te radovima koji govore o povezanosti polimorfizama istih gena i smanjene gustoće kosti u postmenopauzalnih žena, postavlja se logično pitanje: Postoji li povezanost polimorfizama u genima IL-6, TGF-β1 i TNF-α s kraćim preživljavanjem endoporteze zgloba kuka, odnosno ranijim nastankom aeptičke nestabilnosti endoproteze zgloba kuka? 44

6. HIPOTEZA Bolesnici u kojih dolazi do nastanka rane aseptičke nestabilnosti totalne endoproteze zgloba kuka genetski se razlikuju od bolesnika s dugotrajnim i stabilnim endoprotezama. Izabrali smo tri gena: gen interleukin 6 (položaji 572 i 597 u promotorskom području gena), gen tumor nekrotizirajući čimbenik alfa tipa 1 (položaj 308 u promotorskom području gena) i gen transformirajući čimbenik rasta beta tipa 1 (položaj 29 u kodirajučem području). Naravno, nije moguće uključiti sve potencijalno zanimljive gene kandidate u jedno istraživanje. Naš se izbor temeljio na sljedećim činjenicama: IL-6 (nukleotidi na položajima 572 i 594). Interleukin 6 je protuupalni citokin, smatra se medijatorom aseptičke nestabilnosti endoproteze kuka (182,183,184), a sudjeluje i u procesu koštanog remodeliranja (185). U promotorskom području ovog gena postoje polimorfizmi na nekoliko položaja (-597G A, -572G C, -373AnTn, i - 174 G C) (184) i pokazana je njihova povezanost s nekim biološkim fenomenima/kliničkim stanjima na primjer, alel C ( 572) je povezan s većom koštanom masom u pre- i post-menopauzalnih žena (122,190). Način na koji prisustvo tog alela utječe na koštanu masu nije poznat. Postoji mogućnost da prisustvo određenih alela utječe na ekspresiju gena, no regulacija ekspresije IL-6 posljedica je složene interakcije svih spomenutih polimorfizama (188). TNF-α1 (položaj 308). TNF-α1 je također medijator u procesu razvoja aseptičke nestabilnosti. Protupalni je citokin višestrukih mehanizama djelovanja koji imaju aktivirajući učinak na osteoklaste (6, 9, 186). U promotorskom području gena TNF-α1 postoje polimorfizmi na barem dva položaja: -308 (G A) i 238 (G A). Prisustvo nukleotida A na položaju 308 povezano je s povećanom sklonošću većem 45

broju različitih upalnih i zaraznih bolesti (130). Pretpostavlja se da je to posljedica pojačane aktivnosti alela s nukleotidom A na položaju -308 (130). Nedavno se pokazalo (57) da nukleotid A na položaju 238 povećava rizik od nastanka aseptičke nestabilnosti endoproteze kuka, zasad nepoznatim mehanizmom. TGF-β1 (položaj 29). TGF-β1 je snažno ispoljen u periprostetičkom granulacijskom tkivu kod aseptičkih nestabilnih endproteza zgloba kuka i smatra se važnim medijatorom nastanka aseptičke nestabilnosti (6, 9). TGF-β1 djeluje protuupalno i to se djelovanje ostvaruje višestrukim mehanizmima (187). Polimorfizam T A na položaju 29 povezan je s većom koštanom masom u postmenopauzalnih žena (131). Smatra se da bi učinak nukleotida A na ovom položaju mogao za posljedicu imati pojačano ispoljavanje gena kod nositelja ovog alela (131). 46

7. SVRHA I CILJ ISTRAŽIVANJA Svrha planiranog istraživanja je testiranje postavljene hipoteze. Dokazivanje ili odbacivanje dijela ili cijele hipoteze doprinijelo bi boljem razumijevanju genetske osnove nastanka aseptičke nestabilnosti endoproteze kuka. Primarni cilj ovoga istraživanja je ustanoviti postoji li združenost polimorfizama u genima za IL-6, TNF-α1 i TGF-β1 i nastanka aseptičke nestabilnosti endoproteze kuka kao funkcije vremena proteklog od ugradnje endoproteze do pojave aseptičke nestabilnosti. Učinak pojedinog genotipa biti će izražen kao relativni rizik. Sekundarni cilj. Većini bolesnika koji su pristali sudjelovati u ovom istraživanju endoproteza kuka ugrađena je zbog artroze kuka uzrokovane poremećenim razvojem zgloba kuka. Stoga je sekundarni cilj istraživanja određivanje potencijalne razlike u učestalosti pojedinih genotipova u odnosu na zdrave dobrovoljce. 47

8. ISPITANICI, MATERIJALI I METODE 8.1 Oblikovanje istraživanja U svrhu ostvarenja primarnog cilja, provedeno je retrospektivno prognostičko istraživanje upotpunjeno s presječnom ( cross-sectional ) analizom genotipa. Svi podaci vezani uz ugradnju i ishod ugrađenih endoproteza prikupljeni su retrospektivno, zaključno s prosincem 2004. godine. U svrhu ostvarenja sekundarnog cilja, provedeno je istraživanje tipa slučajkontrola, u kojem kontrolni ispitanici nisu bili birani tako da odgovaraju slučajevima po dobi, spolu i broju ( unmatched case-control ). 8.2 Mjesto istraživanja Svi bolesnici operirani su i praćeni u Klinici za ortopediju, KBC Zagreb i Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Genetičke analize učinjene su u Laboratoriju za molekularnu patologiju Zavoda za molekularnu medicinu, Institut Ruđer Bošković, Zagreb. 8.3 Etički aspekt istraživanja Ovo je istraživanje odobreno od strane Etičkog povjerenstva Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu i Etičkog povjerenstva KBC Zagreb. Svi su ispitanici bili obavješteni o prirodi i cilju istraživanja, nakon čega su potpisali informirani pristanak za sudjelovanje u studiji. 48

8.4 Ispitanici U svrhu ostvarenja primarnog cilja, u istraživanje su uključeni bolesnici s ugrađenom totalnom endoprotozom zgloba kuka. U svrhu ostvarenja sekundarnog cilja, u istraživanje je uključena i skupina zdravih dragovoljaca. Bolesnici kriteriji za uključivanje/neuključivanje u studiju Bolesnici, sudionici ovog istraživanja, podskupina su ispitanika koju su bili uključeni u naše prethodno istraživanje u kojem smo analizirali utjecaj biomehaničkih i demografskih čimbanika na pojavu aseptičke nestabilnosti endoproteze zgloba kuka (60). Potencijalni ispitanici za to istraživanje odabrani su pregledom baze podataka Klinike za ortopediju KBC-a. Kriteriji za uključivanje bolesnika bili su: a) informirani pristanak; b) odazivanje na kontrolni pregled u prosincu 2004.g. ( zaključna evaluacija ); c) od ugradnje endoproteze proteklo je 12 godina; d) ugrađena endoproteza sastojala se od Zweymüllerovog bedrenog dijela endoproteze i Endlerove polietilenskog acetabularnog dijela; e) sve proteze je ugradio isti operater (D.O. mentor ove dizertacije); f) tijekom vremena postoperativnog praćenja redovito su se odazivali na kontrolne preglede u približno jednom godišnje (osim ako se nisu javljali spontano, u kraćem razmaku, zbog subjektivnih tegoba); g) ako je tijekom prećenja ustanovljena nestabilnost proteze, ona je bila posljedica nastanka aseptičke nestabilnosti. Kriteriji za neuključivanje u studiju bili su: a) tijekom postoperativnog razdoblja ustanovljeni su drugi čimbenici (osim aseptičke nestabilnosti) koji su mogli utjecati na stabilnost endoproteze (npr.osteomijelitis, trauma); b) nedostajali su podaci (radiogrami) o inklinacijskom kutu acetabuluma neposredno nakon ugradnje endoproteze. 49

U studiju su bila uključena 72 ispitanika (ukupno 82 totalne endoproteze zgloba kuka). Od tog broja, 41 je bolesnik (ukupno 45 endoproteza dva muškarca i dvije žene imali su obostrane endoproteze) pristao sudjelovati (informirani pristanak) u ovom istraživanju. Zdravi dragovoljci Zdravi dragovoljci izabrani su među studentima 5. godine Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu i uposlenicima Klinike za ortopediju KBC-a Zagreb. Uključeni su u studiju ako su bili zadovoljeni ovi uvjeti: a) informirani pristanak za sudjelovanje; b) na temelju anamneze i radiološkog pregleda kukova isključena je mogućnost da boluju od razvojnog poremećaja zgloba kuka. 8.5 Operacijska tehnika i radiološka evaluacija Sve endoproteze sastojale su se od Zweymullerovog bedrenog dijela endoproteze i Endlerove polietilenske acetabularne čašice s navojima (slika 7). Za artroplastiku je korišten modificirani antero-lateralni pristup (Watson-Jones) (1). Postoperacijski inklinacijski kut acetabuluma izmjeren je na rentgenskim snimkama u anteroposteriornoj projekciji koja je, najčešće, učinjena drugog postoperacijskog dana (slika 8). 50

Slika 7. Bolesnica je imala obostrane degenerativne promjene zgloba kuka nastale zbog razvojnog poremećaja. Ugrađena je totalna endoproteza zgloba kuka, polietilenski bescementni acetabularni dio model Endler i bedreni dio model Zweymüller. Zbog loše razvijenog acetabularnog dijela kuka urađena je acetabuloplastika obostrano s autolognim koštanim presatkom uz fiksaciju s jednim vijkom. 51

Slika 8. Program Delphi, Visual Pascal, kojim smo mjerili kut inklinacije acetabuluma, drugi postoperacijski dan. Bedreni dio endoproteze je uvijek bio postavljen u neutralnu poziciju. U kasnijim su kontrolnim pregledima analizirane rentgenske snimke u antero-posteriornoj i lateralnoj projekciji, po metodi DeLee i Charnley (193) (slika 9). Slika 9. Shematski prikaz podjele acetabularnog i bedrenog dijela endoproteze po zonama (188). 52

Područje doticaja acetabularne čašice i kosti, odnosno femoralnog usatka i kosti podijele se u tri, odnosno sedam zona (područja) u svakoj projekciji i svaki se dio posebno analizira. Parametri koji se prate na radiološkim snimkama su: 1) sklerozacija na mjestima prijenosa najvećeg opterećenja s acetabulrnog dijela endoproteze kuka na kost; 2) vidljivi navoji acetabularnog dijela endoproteze mogu se pojaviti u jednoj i/ili više acetabularnih zona; 3) radiolucentna linija (širine 1mm; 1-2mm; 2mm) koja se može se pojaviti u jednoj i/ili više acetabularnih zona; 4) smještaj zahvaćene zone; i 5) pomak endoproteze (medijalno, kranijalno). 8.6 Definicije ishoda mjerenih u istraživanju Sukladno dvama ciljevima istraživanja (primarnim i sekundarnim), definirani su i primarni i sekundarni ishodi istraživanja. 8.6.1. Primarni ishod istraživanja U svrhu ostvarenja primarnog cilja istraživanja (analize utjecaja genskih polimorfizama na preživljenje endoproteze do pojave aseptičke nestabilnosti ), kao primarni ishod istraživanja određeno je vrijeme (izraženo u godinama) koje je proteklo od trenutka ugradnje totalne endoproteze zgloba kuka do postavljanja dijagnoze aseptičke nestabilnosti (acetabularnog i/ili femoralnog dijela) koja zahtjeva reviziju ili do zaključne evaluacije, ovisno koji je od ta dva događaja nastupio prvi. Za postavljanje dijagnoze aseptičke nestabilnosti koja zahtijeva reviziju korišteni su kriteriji Krugluger i Eyb (48): a) stadij 1 stabilna endoproteza (vidljivi navoji ili radilucentna linija 1 mm širine u samo jednom području, sa ili bez sklerozacije; b) stadij 2 rana aseptička nestabilnost: vidljivi navoji ili prisustvo radiolucentnih linija 1-2 milimetra širine u dva područja; c) stadij 3 vjerojatna aseptička nestabilnost: vidljivi 53

navoji ili prisustvo radiolucentnih linija 1-2 mm širine u dva ili više područja, osteolitički defekt veći od 2 mm; d) stadij 4 očita nestabilnost: vidljivi navoji ili prisustvo rediolucentnih linija 1-2 milimetra širine u više područja, osteolitički defekt veći od 2 mm, pomak endoproteze. Radiološki nalaz stadija 2 (acetabularni ili bedreni dio endoproteze) smatran je indikacijom za reviziju ako je bio združen s kliničkim smetnjama, dok su radiološki nalazi stadija 3 i 4 smatrani indikacijom za reviziju, bez obzira na kliničke simptome. 8.6.2. Sekundarni ishod istraživanja Sekundarni ishod istraživanja (u svrhu ostvarenja sekundarnog cilja) bila je prevalencija pojedinih polimorfizama položajima u oboljelih od razvojnog poremećaja zgloba kuka i u zdravih dragovoljaca. 8.7 Analiza polimorfizama u genomskoj DNA Analiza polimorfizama napravljena je na genomskoj DNA ispitanika izdvojenoj iz stanica pune krvi. Lančanom reakcijom polimeraze umnožena su ona područja DNA, odnosno oni dijelovi gena, unutar kojih se nalaze polimorfni nukleotidi (123,128,131). Nakon provjere uspješnosti reakcije u gelu agaroze, umnoženi odsječci cijepani su određenim restrikcijskim endonukleazama (metoda RFLP) i to: IL-6 endonukleazama Fok-1 i BsrB-1 te TNF-α1 endonukleazom Nco-1. Polimorfizam u kodirajučem području na položaju 29 TGFβ-1 ne stvara, odnosno ne briše restrikcijsko mjesto. Stoga se ovaj polimorfizam otkriva korištenjem početnih oligonukleotida čija zadnja baza na 3 kraju pokriva polimorfno mjesto. 54

8.7.1. Korištene kemikalije, puferi, enzimi i gelovi 8.7.1.1. Izdvajanje DNA iz stanica pune krvi - pufer za digestiju: 50 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, 0,5% Tween 20, ph 8,5; - fenol: ekvilibriran i nadsvođen s Tris, ph 7,9; - kloroform (Kemika, Zagreb); - apsolutni alkohol (Kemika, Zagreb); 8.7.1.2. Otapanje DNA -pufer TE: 10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 7,4; 8.7.1.3. Lančana reakcija polimerazom - pufer za PCR (10xTaq Reaction Buffer, Eppendorf) komercijalno dostupan kao l0x koncentriran: 100 mm Tris-HCl, ph 8,3; 500 mm KC1, 15 mm MgCl2 i 0,l% želatina; - pufer za PCR (5x Taq Master (sastav pufera proizvođač ne deklarira); -10 mm smjesa deoksinukleotida : 2,5 mm svaki (dntp: datp, dctp, dgtp, dttp; Eppendorf); - Taq polimeraza 5 U/µl (TaKaRa, Japan). 8.7.1.4. Elektroforeza genomske DNA i odsječka PCR u gelu agaroze -pufer TAE: 40 mm Tris-acetat, 1 mm EDTA, ph 8,0; -agaroza tipa I (Sigma); -pufer za nanošenje (engl. loading buffer): pripremljen kao 6x koncentriran: 0,25% bromofenolno modrilo (Sigma), 0,25% ksilen cijanol (Sigma) i 30% glicerol (Kemika, Zagreb). 55

8.7.1.5. Restrikcije odsječaka PCR -pufer 2 (New England BioLabs): 50 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl2, 1 mm DTT, ph 7,9 pri 25 C; dostupan kao l0x koncentriran i koristi se s restrikcijskom endonukleazom Bsrb1; -pufer 4 (New England BioLabs): 50 mm K-acetat, 20 mm Tris-acetat, 10 mm Mgacetat, l mm DTT, ph 7,9 pri 25 C, dostupan kao l0x koncentriran i koristi se s restrikcijskim endonukleazama: Nco1 i Fok1. 8.7.1.6. Elektroforeza u 15% gelu poliakrilamida -pufer TBE: 90 mm Tris-borat, 1 mm EDTA, ph 8,3; -pufer za nanošenje (engl. loading buffer): pripremljen kao 6x koncentriran: 0,15% bromfenolno modrilo (Sigma), 0,15% ksilen cijanol (Sigma) i 40% glicerol (Kemika, Zagreb); -30% otopina akrilamid/bisakrilamid (Roche); -TEMED (N,N,N,N-tetrametiletilendiamin) (Serva); -10% otopina amonij-persulfata (APS) (Kemika). 8.7.1.7. Standardi DNA -standard V: odsječci veličina 8-587 pb (Roche); -standard X: odsječci veličina 76-12216 pb (Roche); -standard XIII: odsječci veličina 50-2642 pb (Roche). 8.7.1.8. Bojanje restrikcijskih ulomaka DNA srebro-nitratom -10% otopina etanola; -oksidans: 1% otopina dušične kiseline (HNO3) (Kemika, Zagreb); -srebro za bojanje: 0,2% otopina srebro (I)-nitrata (AgN03) (Kemika, Zagreb); 56

-razvijač: 3% otopina natrij-karbonata (Na2CO3) + 500 µl 36% formalina (konačna koncentacija 0,018%) (Kemika, Zagreb); -otopina za zaustavljanje reakcije: 5% otopina octene kiseline (Kemika, Zagreb). 8.7.1.9. Početni oligonukleotidi U lančanoj reakciji polimerazom koristio sam početne oligonukleotide prikazane u tablici 3. 8.7.1.10. Enzimi U postupku izdvajanja DNA koristio sam enzim proteinaza K (Sigma), koncentracije 20 mg/ml. U analizi određivanja različitih duljina restrikcijskih ulomaka (RFLP), koristio sam tri restrikcijske endonukleaze prikazane u tablici 3. 57

Tablica 3. Početni oligonukleotidi i očekivana veličina odsječaka nakon analize PCR/RFLP Gen Oligonukleotidi Broj ciklusa i temperatura sparivanja IL 6 Početni oligonukleotidi: 5'- GCA ACT TTG AGT GTG TCA CG-3' 5'-TGA CGT GAT GGA TGC AAC AC-3' TGF ß1 A. 5'-CTC CGG GCT GCG GCT GCT GCT-3' B. 5'-CTC CGG GCT GCG GCT GCT GCC-3' C. 5' GTT GTG GGT TTC CAC CAT TAG-3' TNF- α1 Početni oligonukleotidi: 5'-AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT-3' 35 ciklusa / 57 C 35 ciklusa /57 C 40 ciklusa/ 62 C 40 ciklusa / 62 C 35 ciklusa / 57 C Dužina odsječka Tip polimorfizma Restrikcijska endonukleaza Restrikcijske sekvence 163 bp -597 A C Fok-1 5 GG ATG(N) 9 3 3 CC TAC(N) 13 5 Dužina dobivenih odsječaka 115/48 Literatura 163 bp -572 G C BsrB-1 5 CCG CTC3 101/62 128 346 bp 29 T C 131 107 bp -308 G A Nco-1 5 C CA TGG3 128 42/65 123 5'-TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG-3' 58

8.7.1.11. Priprema 1% i 2% gelova agaroze 1% gel agaroze pripremio sam vaganjem 0,6 g agaroze koju sam prenio u tikvicu i dodao 60 ml pufera 1xTAE. Za pripremu 2% gela koristio sam 1,2 g agaroze u istom volumenu. Otapanje agaroze pospješio sam zagrijavanjem do točke ključanja u mikrovalnoj pećnici, u tekuću agarozu dodao sam 3 µl etidij-bromida (konačna koncentracije 0,5 µg/ml), a potom je ohladio pod mlazom vode uz lagano miješanje do približno 50 C te izlio u prethodno pripremljen kalup kadice sastavnog dijela sustava za elektroforezu Mini-Plus Horizontal Gel Unit HU 10 (Scie-Plas, UK). 8.7.1.12. Priprema 15% gela poliakrilamida Izmiješao sam 15 ml 30% otopine poliakrilamida (bisakrilamid (Sigma) i akrilamid (Sigma) u omjeru 1:29), 12 ml destilirane vode i 3 ml pufera TBE. Nakon toga sam dodao 16 µl TEMED i 200 µl APS, otopinu promiješao i ulio između dva stakla sistema za okomitu elektroforezu. U tako napunjen sistem postavio sam češalj, pomoću kojeg će se tijekom polimerizacije gela, tijekom jednog do dva sata, formirati jažice. 8.7.2. Postupci u analizi polimorfizama u genomskoj DNA 8.7.2.1. Izdvajanje DNA iz stanica pune krvi Na 5 ml pune krvi dodao sam 5 ml sterilne deionizirane vode i 50 µl 1% deterđenta NP-40. Nakon miješanja, uzorak sam ostavio na sobnoj temperaturi tijekom 5 minuta i zatim centrifugirao na 7 000 rpm tijekom 5 minuta (Eppendorf 5415 C) Supernatant sam odvojio, a na zaostali talog ponovno dodao sterilnu deioniziranu vodu i postupak ponovio još dva puta. Na talog sam dodao 800 µl pufera za digestiju i proteinazu K u konačnoj koncentraciji 100 µg/ml. Uzorak sam inkubirao na 37 C, preko noći, uz stalnu trešnju. 59

Nakon toga sam uzorak razdijelio u dvije mikroepruvete volumena 2 ml te dodao jednak volumen fenola nadsvođenog s Tris. Mikroepruvete sam pričvrstio na kružnu ploču (Rotex), na kojoj se mješavina lagano miješala tijekom narednih 10 minuta, a zatim centrifugirao na 10 000 rpm tijekom 10 minuta, što je omogućilo razdvajanje vodene i fenolne faze. Odvojio sam gornju, vodenu fazu i prenio je u novu mikroepruvetu. Dodao sam jednak volumen mješavine fenol-kloroform (1:1) te ponovio postupak miješanja i centrifugiranja. Ponovo sam odvojio gornju, vodenu fazu kojoj sam dodao jednak volumen kloroforma. Nakon ponovnog miješanja, gornjoj, vodenoj fazi, dodao sam dva i pol volumena apsolutnog etanola ohlađenog na -20 C i uzorke stavio na precipitaciju tijekom noći na 20ºC kako bi se DNA istaložila. Slijedeći sam dan odvojio DNA centrifugiranjem na 14 000 rpm tijekom 20 minuta. Iz epruvete sam uklonio alkohol a na istaloženu DNA dodao, ovisno o zaostalom talogu, 50-200 µl pufera TE. Otpoljenu DNA pohranio sam na +4 C. Količinu DNA odredio sam spektrofotometrijski na valnoj duljini od 260 nm. Pri izračunavanju koncentracije koristio sam formulu: DNA (µg/ml) = A260 x razrjeđenje x 50. Kvalitetu DNA provjerio sam elektroforezom u 1% gelu agaroze. 8.7.2.2 Lančana reakcije polimeraze Koristeći 100 ng DNA izdvojene iz stanica pune krvi umnažao sam odsječke gena za interleukin 6, tumor nekrotizirajući čimbenik alfa tipa 1 i transformirajući čimbenik rasta beta tipa 1. Reakcijska smjesa volumena 25 µl sastojala se od: - početni oligonukleotidi: 10 pmola (konačna koncentracije: 400 nm); - Taq polimeraza: 0,625 jedinica; 60

- 8 µl Taq Master Mix; - sterilna deionizirana voda do 25 µl; Za izvođenje reakcija koristio sam aparat PerkinElmer GeneAmp PCR System 2400. Pojedinačni ciklusi umnažanja i temperatura sparivanja početnih oligonukleotida prikazani su u tablici 4. 8.7.2.3. Provjera uspješnosti umnažanja lančane reakcije polimerazom Uspješnost reakcija umnažanja provjeravao sam u 2% gelu agaroze pripremljenom u puferu 1xTAE uz prisustvo DNA standarda X (slika 7). U jažice gela nanašao sam po 6 µl uzorka PCR pomiješanog s 1 µl pufera za nanošenje. Elektroforeze su trajale približno 30 minuta pri naponu od 130 V. Gelove u kojima su vidljivi odsječci DNA, pogledao sam pod UV-svijetlom transiluminatora. Fotografirao filmom Polaroid tipa 667. Slika 10. Primjer provjere uspiješnosti umnažanja lančane reakcije polimeraze u 2% gel agaroze. 61

8.7.2.4. Analiza polimorfizama u genima IL -6 i TNF-α1 metodom RFLP Za određivanje postojanja poznatih polimorfizama u genima I -6 i TNF-α1 koristio sam metodu RFLP. Koristio sam poznate odsječke i restrikcijske endonukleaze (tablica 3). U mikroepruvetu Eppendorf volumena 1,5 ml stavio sam 2,5 µl pufera za restrikciju, 400 ng DNA umnožene u PCR, i po 20 U restrikcijske endonukleaze. Volumen sam, do 25 µl, nadopunio sterilnom deioniziranom vodom. Nakon inkubacije, koja se odvijala preko noći na temperaturi od 37ºC u mješalici, u smjesu sam dodao 3 µl pufera za nanošenje i uzorke pohranio na +4 C. Veličinu dobivenih odsječaka provjeravao sam u 15 % gelu. U jažice 15% gela poliakrilamida nanosio sam 15 µl uzorka, uz obavezno nanašanje 50 ng standarda DNA poznatih veličina odsječaka (standardi: V, X i XIII). Srednje vrijeme trajanja elektroforeze bilo je 2-3 sata na 300 V. Po završetku elektroforeze, gel sam odvojio od stakla i fiksirao u 10% alkoholu tijekom 10-15 minuta. Nakon toga sam ga bojao srebrom. Bojanje se sastoji od tri osnovna koraka: oksidacije, vezanja srebra i razvijanja slike redukcijom srebra. Gel sam fiksirao u 10% EtOH tijekom 20 minuta. Nakon uklanjanja etanola, uronio sam gel u 1% otopinu dušične kiseline, tri do pet minuta uz stalnu trešnju. Nakon toga sam ga isprao u destiliranoj vodi (2-3 puta). Dodao sam 0,2 % otopinu srebra (AgNO3) u kojoj je gel bio narednih 20 do 30 minuta. Ponovno sam ga ispirao u destiliranoj vodi. Konačno, na gel sam dodao hladni razvijač (+ 4 C). Pri najmanjoj pojavi zamućenja, uklanjao sam 62

razvijač i dodavao novi. Razvijanje slike trajalo je približno 15-20 minuta. Reakciju sam zaustavio dodavanjem 5% octene kiseline. Analiza reakcije cijepanja je učinjena nakon elektroforeze odsječaka u nedenaturirajućem gelu poliakrilamida i bojenja gela otopinom srebro-nitrata. Ovisno o prisutnosti određenog nukleotida, moguća su tri ishoda reakcije cijepanja restrikcijskim endonukleazama: a) niti jedan alel ne posjeduje restrikcijsko mjesto (necijepani homozigot), a na 15% poliakrilamida gelu se prikazuje samo PCR odsječak; b) oba alela posjeduju restrikcijsko mjesto (cijepani homozigot), na 15% poliakrilamida gelu se ne prikazuje PCR odsječak, več cijepana oba alela; c) jedan alel posjeduje, a drugi ne posjeduje restrikcijsko mjesto (heterozigot), na15% poliakrilamida gelu se prikazuje uz PCR odsječak jednog alela, te cijepane odsječke drugog alela (slika 11). 63

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 163 pb Slika 11. Primjer analize polimorfizama u genu IL-6 metodom RFLP u 17 bolesnika (linija 2-19); gen IL-6, veličina odsječka 163bp; restrikcijska endonukleaza BsrB-1. Linija 1: standard DNA V; Linija 9: heterozigot tipa GC ; Linija10-18: homozigot tipa CC ; Linija 19: homozigot tipa GG ; Linija 20: standard DNA X. 8.7.2.5. Analiza polimorfizma u genu TGF-β1 metodom PCR Polimorfizam kodirajučeg područja 29 TGF-β1 ne stvara odnosno ne briše restrikcijsko mjesto. Stoga se ovaj polimorfizam otkriva korištenjem početnih oligonukleotida čija zadnja veza na 3 kraju pokriva polimorfno mjesto (tablica 3). U 64

ovom slučaju, polimorfni nukleotidi u genomskoj DNA su A i G. Stoga su početni nukleotidi konstruirani tako da se na njihovim 3 krajevima nalaze nukleotidi T i C. Ako se amplifikat dobije s obadva uzvodna početna oligonukleotida, osoba se smatra heterozigotom. Ako se amplifikat dobije samo s početnim oligonukleotidom A, onda je osoba homozigot tipa A/A. Ako se amplifikat dobije samo s početnim oligonukleotidom B, onda je osoba homozigot tipa G/G (slika 12). TGFβ 1 2 3 4 5 6 7 2% gel agaroze Slika 12. Primjer analize polimorfizma u genu TGF-β1 metodom PCR napravljena u tri bolesnika. Gen TGF-β1; veličina odsječka 346bp. Linija 1: standard DNA XIII; Prvi ispitanik je homozigot tipa AA (linija 2 je kombinacija oligonukleotida A/C, a linija 3 je kombinacija oligonukleotida B/C i amplifikat nije prisutan). Drugi ispitanik je heterozigot tipa A/G (linija 4 je kombinaca oligonukleotida A/C, a linija 5 je kombinacija oligonukleotida B/C). Treči ispitanik je homozigot tipa GG (linija 6 je kombinacija oligonukleotida A i C i amplifikat nije prisutan, a linija 7 je kombinacija oligonukleotida B/C). 65